[发明专利]低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于：所述的嵌合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2，或氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的嵌合蛋白ΔSEC2 –ΔSak。

2.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2的方法，其特征在于步骤如下：

1）构建载体pET 28a-Δsak- linker-Δsec2，Δsak- linker-Δsec2的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；

2）将得到的载体pET 28a-Δsak- linker-Δsec2经   PCR去除Δsak和Δsec2之间的linker，构建出表达嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2的质粒pET28a-Δsak -Δsec2，Δsak -Δsec2的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；

3）将质粒pET28a-Δsak -Δsec2转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；

4）将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1 mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞；

5）用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300 W；处理时间：6×9 sec，9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；

6）将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白His-ΔSak-ΔSEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

7）嵌合蛋白His-ΔSak-ΔSEC2经过肠激酶切割，再次过Ni-NTA亲和层析柱，得到嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白ΔSEC2 –ΔSak的方法，其特征在于步骤如下：

1）构建载体pET 28a-Δsec2- linker-Δsak，Δsec2- linker-Δsak的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；

2）将得到的载体pET 28a-Δsec2- linker-Δsak经   PCR去除Δsec2和Δsak之间的linker，构建出表达嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak的质粒pET28a-Δsec2 -Δsak，Δsec2 -Δsak的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；

3）将质粒pET28a-Δsec2 -Δsak转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；

4）将重组大肠杆菌接种于LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1 mM IPTG诱导4～5小时，之后离心收集菌体细胞；

5）用超声波破碎菌体细胞，功率：200-300 W；处理时间：6×9 sec，9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；

6）将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白His-ΔSEC2-ΔSak，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

7）嵌合蛋白His-ΔSEC2-ΔSak经过肠激酶切割，再次过Ni-NTA亲和层析柱，得到嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.权利要求1所述的低免疫原性嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。