[发明专利]低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用，属于微生物学，分子生物学和基因工程领域。 

背景技术

2009年，美国ASCO主席在介绍肿瘤进展时提到，癌症的第一死亡原因是癌症本身和癌症复发，第二位死因就是血栓。癌症与血栓的关系非常密切，重视癌症血栓的预防和治疗已成为临床医生今后工作的重点之一。

1865年，法国医生Armand Trousseau 首次报道了胃癌患者容易形成静脉血栓，不久，Billroth又于1878年发现了血栓中存在癌细胞，进一步提出癌变可引起凝血功能紊乱。临床上把肿瘤相关性血栓称为Trousseau综合症。大量的病理、实验和临床研究证实了这一现象，而且还发现，几乎所有的癌症患者都存在局部或全部高凝状态。

癌症患者的血栓性疾病包括深静脉血栓(deep venous thlmmbosis，DVT)、肺栓塞(pulmonary embolism，PE)、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)、门静脉血栓(portal vein thmrnbosis，PVT)和动脉血栓栓塞(arterial thromboembolism，AT)、游走性浅表血栓性静脉炎(migratory thrombophlebitis superficial)等，其中下肢DVT最为常见。

癌症患者血栓形成的发病机理相当复杂，至今尚未完全明确。多种因素通过不同途径共同导致了癌症患者的血栓易患倾向，主要包括抗癌治疗、肿瘤细胞的表达物及释放物和致癌基因等因素。

抗癌治疗导致血栓形成，主要是手术治疗期间形成血栓，化疗药物和放射治疗诱发血栓形成以及患者在接受中心静脉穿刺置管治疗期间，管周纤维蛋白鞘导致血栓形成。

癌症患者所患的血栓性疾病与肿瘤细胞表达和释放的物质关系密切。肿瘤细胞可通过释放促凝因子或炎性因子来直接或间接地激活凝血级联反应，另一方面，炎性因子亦可刺激肿瘤细胞释放更多的促凝因子而加剧血液的高凝状态。肿瘤细胞表达和释放的三种主要促凝物质为：组织因子（TF）、癌促凝物质（cancer procoagulant CP）和丝氨酸蛋白酶（hepsin）。

新近的研究表明，某些致癌基因在促进细胞恶变的同时也能够引起凝血功能紊乱。如Yu J等证实，导致癌症产生的某些基因病变如Ras基因活化或p53基因失活能够造成组织因子（TF）的过度表达，诱发凝血病变。

最近的研究还显示，血栓形成参与了肿瘤的进展、血管生成和转移等机制。除了癌症治疗形成血栓可视为外界因素外，其余两种因素所形成的血栓都是应机体癌变出现的。研究发现，血栓的形成有利于肿瘤发生和发展的机制可能是纤维蛋白沉积于肿瘤细胞周围为肿瘤生长提供了2个便利条件：一方面为肿瘤细胞附着提供了基质，利于其局部扩散和蔓延；另一方面，纤维蛋白凝血块和相关的凝血因子能够上调血管内皮细胞生长因子的表达（VEGF），从而为新生血管创造了条件。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxins, SEC2)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)的加工，也不受组织相容性复合体(MHC)的限制，在APC之外与T细胞受体Vβ链形成MHCII-SE-TCRVβ复合物，在极低浓度时就能刺激大部分有TCRVβ序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。SEC2可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(Sag-dependent cell-mediated T-cell-derived cytotoxicity, SDCC)，从而产生系统的抗肿瘤反应。但作为潜在胃肠毒素，SEC2可引起食物中毒，引发腹绞痛和腹泻，作为外源蛋白，SEC2分子量大，易引起超敏反应。N端17个氨基酸以及C端132个氨基酸缺失的ΔSEC2分子量小，毒副作用降低，而其抗肿瘤活性得以保持。

葡激酶(staphylokinase, Sak)是由具有溶原性的金黄色葡萄球菌在指数期后期产生、分泌的一种胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用机制是激活体内溶栓系统，即通过激活纤溶酶原(Plg)转变成纤溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓药物，同其它的溶栓药物比较，葡激酶具有溶栓活力强，溶栓作用专一，免疫原性低以及过敏反应少等多种特点，而且当血栓被溶解后，葡激酶对纤溶酶原的激活作用会受到人体内α2抗纤溶酶的抑制，避免了出血反应。并且N端缺失10个氨基酸的ΔSAK的抗血栓活性与SAK的活性相似。