[发明专利]一种基于家蚕杆状病毒多角体溶解特性的融合蛋白纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种基于家蚕杆状病毒多角体溶解特性的融合蛋白的表达、纯化方法，还涉及一种用于实施上述融合蛋白表达、纯化方法的高效融合表达载体。

背景技术

在生命科学研究和生物制品的生产过程中，利用表达载体制备重组蛋白时最重要的技术之一，获得大量有活性的重组蛋白是进行生物制品研究和生产的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求，同时也是影响基因表达水平及蛋白活性的重要因素。现有的表达载体主要有非融合型表达载体和融合型表达载体两大类，可根据不同的实验设计来选择适当的载体进行表达。一般来说，非融合型表达载体虽然能较好的保持外源蛋白的一级结构，但其表达量较低、外源蛋白分离纯化困难，回收率低，分离纯化工艺复杂，工业上大规模生产的成本较高；融合型表达载体虽然表达量相对较高、可以通过分离/纯化标签等进行分离纯化，但由于融合了一段外源蛋白往往会影响所表达外源蛋白的活性，影响重组蛋白的功能。因此，表达效率高、易于纯化、生物活性好的重组蛋白生产方法成为关键。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速简便的蛋白纯化方法，将家蚕多角体基因(Polh)与目的蛋白基因构建到原核表达载体中，并在二者之间引入一个蛋白酶酶切位点，使其在原核表达菌中融合表达；利用多角体蛋白在碱性条件下溶解而中性条件下沉淀的溶解度特性，通过不同pH值缓冲液对诱导菌体超声后的沉淀进行洗涤，将最后收集所得沉淀用高pH的缓冲液溶解，离心后将收集的上清pH值调回到中性条件，离心收集沉淀即为分离纯化得到的融合蛋白；特异性蛋白酶酶切纯化后融合蛋白的多角体蛋白标签，再通过镍柱分离纯化得到目的蛋白，建立了原核表达的基于家蚕多角体蛋白溶解度特性的融合蛋白纯化方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种在原核表达载体中表达外源蛋白的方法，其特征在于将家蚕多角体基因(Polh)与外源目的蛋白基因置于同一阅读框中进行融合表达，所述家蚕多角体基因与外源目的蛋白基因之间包括编码蛋白酶酶切位点的linker。

本发明所述的表达外源蛋白的方法，其特征在于所述的家蚕多角体基因、编码蛋白酶酶切位点的linker以及外源目的蛋白基因三者之间可操作性的连接。

本发明所述的表达外源蛋白的方法，其特征在于所述的家蚕多角体基因还带有纯化和/或鉴定标签。

本发明所述的表达外源蛋白的方法，其特征在于用针对linker编码酶切位点的蛋白酶切割所表达的融合蛋白，能够产生外源目的蛋白。

优选地，上述的蛋白酶酶切位点为TEV蛋白酶酶切位点。

本发明还提供一种核酸构建体，其包括一个与启动子可操作性连接、并由该启动子控制的阅读框，所述的阅读框包括家蚕多角体基因(Polh)、编码蛋白酶酶切位点的linker以及多克隆位点(用于插入外源目的蛋白基因)。

本发明所述的核酸构建体，其特征在于所述外源蛋白基因通过限制性核酸内切酶位点与所述核酸构建体的其它部分可操作性地连接。

本发明所述的核酸构建体，其特征在于所述的家蚕多角体基因还带有纯化和/或鉴定标签。

优选地，本发明所述的核酸构建体的蛋白酶酶切位点为TEV蛋白酶酶切位点。

本发明进一步提供包含本发明所述的核酸构建体的载体或细胞，以及利用本发明所述的核酸构建体或载体、细胞表达外源蛋白的方法。

本发明还提供一种所述方法表达的外源蛋白的纯化方法，其特征在于将所表达的融合蛋白沉淀溶解于强碱性溶液中，离心收集上清，然后将pH值调至6.0-8.0的近中性，离心收集沉淀即为纯化后的融合蛋白，所述的强碱性溶液pH值为11-14。

本发明所述的外源蛋白的纯化方法，其特征在于将所表达的融合蛋白沉淀溶解于强碱性溶液之前，先用弱碱性溶液洗涤沉淀1-3次，所述弱碱性溶液的pH值为8.0-10.0。

本发明所述的外源蛋白的纯化方法，其特征在于将纯化后的融合蛋白用针对linker编码酶切位点的蛋白酶进行切割，分离纯化所述外源目的蛋白。

本发明所述的外源蛋白的纯化方法，其特征在于还包括将融合蛋白用所述蛋白酶切割后，对蛋白酶切割产物进行鉴定的步骤。

本发明所述的外源蛋白纯化方法，其特征在于通过相应于所述家蚕多角体基因上纯化鉴定标签的纯化方法分离所述外源蛋白和家蚕多角体蛋白。

有益的技术效果