[发明专利]一种创伤弧菌PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种创伤弧菌PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，主要分布于近海海洋环境中，因此又称海洋弧菌，是水产养殖虾、蟹和牡蛎等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌之一。与霍乱弧菌、肠炎弧菌并列为造成人类感染疾病之三大弧菌之一。人类通过食用被该菌污染的水产品或因创口接触带菌的海水和海洋生物而受传染，临床症状主要表现为胃肠道感染、严重的伤口感染、蜂窝组织炎、败血症及肢体坏死，过程相当迅速且死亡率高。一旦出现败血症，其病死率高达50～60％，在我国创伤弧菌感染多发于沿海地区。

由于创伤弧菌的高致病性危害，引起了世界各国的广泛关注，业已成为水产养殖和进出口水产重点检验检疫的致病菌之一。目前对该菌的检测仍以分离培养和理化鉴定为主，该方法虽然可靠，但整个过程耗时费力，灵敏度比较差，不能满足快速检测的需要。特别是由于创伤弧菌本身的表型不稳定，非典型菌株较多见，使得鉴定过程和结果复杂化。免疫学方法主要有免疫荧光、放射免疫法检测和酶联免疫吸附试验等，这些方法虽然具有一定的特异性和敏感性，但通常需要结合细菌分离才能进行，也难满足快速检测的需要。

随着分子生物学技术的发展，检测手段的日益改进，RT-PCR技术已被应用于细菌的诊断。虽然常规PCR法已具备快速、特异、灵敏度高的优点，但由于死菌中的DNA降解速度较慢，不能区分死菌和活菌，而对于某些感染性疾病来说，明确标本中的细菌死活可以使治疗更具针对性。RT-PCR技术是一种新的简便、快速、灵敏、特异并能区分细菌死活的检测手段。目前未有利用RT-PCR技术检测创伤弧菌的检测方法，以及对创伤弧菌toxR特定基因片段具有特异性的RT-PCR引物的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够特异性检测创伤弧菌的PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种创伤弧菌PCR检测试剂盒，主要包括PCR特异性扩增引物、DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物和PCR缓冲液，其特征在于：所述特异性扩增引物如下：

v-toxR(+)：5′-TGATTCCAGCCTAACTCAAG-3′

vv-toxR(-)：5′-TTTGAACCGCGTCAGTACTG-3′。

本发明试剂盒的关键在于引物的设计，试剂盒中的其他组分，如DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物和PCR缓冲液等，对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。

本发明试剂盒的靶基因为创伤弧菌的toxR(Vibrio vulnificus transmembrane regulatory protein ToxR)-GenBank登陆号：AF170883，本发明引物与所述靶基因的21位～250位核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明扩增产物序列如下：tgattccagc ctaactcaag cgatttctac cttacgcaaa atgctcaaag actctacaaa gtcccctgag tttgtgaaaa cggttccaaa acgtggttat cagttgatct gttcggttga gcgcattaac ccgctcctgt cagattcaac caacaacgtg aatgacgcag cttctgaagc attagatcaa gaagaattag aaaacgaaat cagtactgac gcggttcaaa，全长230bp。

本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测样品中创伤弧菌的方法，所述方法包括：

(1)按常规方法提取待测样品DNA；待测样品可以是鱼体的发病部位，如体表或相关组织，可直接提取DNA作为模板；待测样品也可以是细菌待检测标本，待测细菌用普通营养肉汤培养基37℃培养过夜，取1ml增菌液进行模板RNA的提取，并经反转录得cDNA作为扩增模板；

(2)以待测样品DNA为模板，加入特异性扩增引物、DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物和PCR缓冲液配制PCR反应液，进行PCR扩增；所述特异性扩增引物如下：

v-toxR(+)：5′-TGATTCCAGCCTAACTCAAG-3′

vv-toxR(-)：5′-TTTGAACCGCGTCAGTACTG-3′；

(3)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶，150V电泳约20min)，若电泳结果出现230bp特异性条带，则判断为阳性，否则为阴性。