[发明专利]一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法及试剂盒。

背景技术

苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因位于12号染色体(12q22-12q24.1)，大约由1.5Mb碱基组成，编码区包含13个外显子和12个内含子，mRNA大小为1353bp，翻译成含451个氨基酸的酶单体。PAH基因的突变具有以下特点：1.突变位置多变；2.突变类型多样。迄今已发现530种以上的PAH基因突变类型，遍及所有的外显子，国内已发现30余种，其中60％以上是错义突变。PAH是由肝脏产生的一种氨基酸代谢酶，催化苯丙氨酸变成酪氨酸的反应，从而参与糖异生的过程，是细胞内苯丙氨酸代谢过程中必须的酶。因此，对PAH基因进行测序，确定该样本中的PAH基因的序列，具有重要的意义。

目前，对PAH基因进行测序的常见方法为Sanger测序法，通过Sanger测序法能够对目标区域进行区域检测，但是Sanger测序法每次只能对一个样品的PAH基因的某一段区域(不大于900bp)进行测序，检测效率低，测序成本高，且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品的信号时会出现双峰乃至多峰，导致测序所得的测序峰图紊乱，甚至无法分析得到的序列信息，测序失败。大量的研究已经证实，PCR产物直接测序法仅能于混合模板中检测出比例≥20％的模板，且无法得出发生突变位点的精确变异比例。而现有技术中基于Sanger测序法的试剂盒存在同样的缺陷。

因此，需要一种检测苯丙氨酸羟化酶基因的新方法和新试剂盒，能够同时对PAH基因的多个区域进行区域检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法及试剂盒，能同时对PAH基因的多个目标区域进行区域检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行检测。

本发明是这样实现的，一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法，包括以下步骤：

A.利用PAH基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，并基于扩增产物构建测序文库；

B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；

C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。

其中，所述步骤A包括以下步骤：

A1.利用PAH基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到与所述多个目标区域对应的扩增产物；

A2.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

其中，步骤A2包括以下步骤：

A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；

A22.利用接头元件，与片段化产物进行连接，构建测序文库。

步骤A所述的目标区域测序文库的长度无特殊限制，优选为25bp～500bp。更优选为50bp～200bp，更优选为70bp～130bp。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；

A222.环化第一连接产物，得环化产物；

A223.II s型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；

A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；

A222’.II s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得带有第四接头的酶切片段；

A223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。

其中，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。该第一标签序列，优选为带有特定破基序列的核酸分子，其碱基数不限。

进一步的，该第一标签序列碱基数为3～20，更优选为4～10。

其中，步骤A所述的特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。