[发明专利]一种微量磷酸化多肽除盐小柱

说明书

技术领域

本发明涉及一种微量磷酸化多肽除盐小柱TMTip_PPY-C18，这种小柱将聚吡咯和C18固定相以串联的方式装填于微量移液枪头(Tandem Polypyrrole-C18 packed micropipette tip，简称为TMTip_PPY-C18)。该发明适用于分析微量生物样品如细胞、组织中蛋白质磷酸化位点，是一种综合静电相互作用、∏-∏堆积相互作用、疏水相互作用的分离方法。

背景技术

细胞中大量蛋白质都会发生翻译后磷酸化修饰，这种修饰直接参与多种信号传导通路，它的蛋白调控网络是许多药物的作用靶标。分析磷酸化修饰的难点在于这种修饰蛋白的丰度非常低，因此需要发展新型材料进行磷酸化多肽的富集。金属氧化物如二氧化钛是目前为止分离富集磷酸化多肽效果最好的材料之一，但是用这种方法需要采用高达1M的磷酸铵溶液进行洗脱，高浓度的盐在进一步进行质谱分析时严重干扰待测样品信号，甚至完全不能检测到相应信号。

现有的技术中，基于反相C18的ZipTip是最有效的除盐小柱，也是目前唯一使用的除盐技术。该技术利用疏水相互作用保留多肽，而盐不能在这种小柱保留，上样后用含0.1wt％三氟乙烯(TFA)水溶液清洗，而多肽用含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱，因此达到除盐的目的，洗脱液可用于质谱分析。ZipTip_C18的缺点是不能有效保留磷酸化修饰多肽，或者一些亲水性较强的小肽。一个多肽上带负电荷的磷酸基团越多，其亲水性越强，因而越不能被保留，常常被0.1wt％TFA水溶液洗掉。本发明利用聚吡咯酸性溶液中氮原子上所带正电荷与带负电荷的磷酸基团的静电相互作用，以及聚吡咯上不饱和双键与多肽上含芳环氨基酸，比如H、F、Y、W的∏-∏堆积相互作用，增强对各种多肽的保留。本发明不仅可以在酸性条件下使用，也可以在碱性条件下使用，因此使得一些在酸性条件下不溶解的多肽得以被检测，因此扩大了磷酸化蛋白质组学研究领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微量磷酸化多肽除盐方法。一种微量磷酸化多肽除盐小柱TMTip_PPY-C18。该方法简单，能够对含高浓度盐的多肽进行除盐处理，适合于质谱分析。

实现本发明的技术方案：

一种微量磷酸化多肽除盐小柱，该小柱利用反相C18与聚吡咯复合物做分离材料，采用下述方法制成，制备包括以下步骤：

1)、称取0.01克石英棉于离心管，加入1毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；

2)、将100微升浓度为20微克/微升过硫酸铵水溶液快速加入步骤1)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；

3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中；

4)、将保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTip_C18移液管，用移液器将之填紧；

5)、密封微量移液管上端即得。

本发明的微量磷酸化多肽除盐小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、称取0.01克石英棉于离心管，加入1毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；

2)、将100微升浓度为20微克/微升的过硫酸铵水溶液快速加入步骤1)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；

3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中；

4)、将步骤3)保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTip_C18移液管上部，用移液器将之填紧；

5)、密封微量移液管上端即得。

本发明的微量磷酸化多肽除盐小柱的应用，其特征在于，应用于胰蛋白酶解液质谱分析，其做法是，将微量磷酸化多肽除盐小柱依次用含0.1wt％TFA的80wt％乙腈溶液、0.1wt％TFA水溶液清洗各三次；pH 8为的胰蛋白酶解液先用0.1wt％TFA调至酸性，使pH 2～3，或直接上样；然后用0.1wt％TFA水溶液清洗两次，最后用含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱，洗脱液用于质谱分析。

本发明的效果和优点：

1.本发明制备的微量磷酸化多肽除盐小柱，反应条件温和，无需有毒有害试剂。

2.整个工艺过程简单易控制，耗能少，产率高，成本低，符合实际生产需要。