[发明专利]一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白的重组表达方法及其应用，特别是涉及一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其在抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的ELISA检测中的应用。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)属于疱疹病毒科，α病毒属，人是其唯一宿主，因此又称人疱疹病毒3型，感染后可引起两种不同的临床病理症状。VZV初次感染多发于青少年时期，表现为全身性的水疱疮(水痘)，此后，病毒潜伏在感觉神经节，当携带者由于免疫力低下等原因，病毒可再次激活而引发带状疱疹(病毒通过神经传播，到达表皮细胞，沿肋间神经区域形成水疱疹症状)。VZV的初次和再次感染均会引起中枢神经系统的病理症状，多表现为脑膜炎、脑炎、面瘫等，但往往不伴随疱疹体征，因而不利于该病毒感染的临床诊断和早期抗病毒治疗。

目前，临床多采用提取病人脑脊髓液中的核酸，进行探针法定量PCR确定患者是否为VZV感染。但Steiner等(Steiner I，Budka H，Chaudhuri A，et al.Viral meningoencephalitis：a review of diagnostic methods and guidelines for management.Eur J Neurol.2010，17：e957-e999.)证明PCR鉴定受限于采样的窗口期，因此，虽然该方法具有很好的灵敏性，但易造成假阴性，并且VZV基因组与其它人α-疱疹病毒基因组，特别是单纯疱疹病毒，具有很高的同源性，因而不排除有假阳性的检测结果。基于上述原因，研究者将VZV感染的诊断转向血清学的检测方法，Breuer等(Breuer J，Schmid DS，Gershon AA.Use and limitations of varicella-zoster virus-specific serological testing to evaluate breakthrough disease in vaccines and to screen for susceptibility to varicella.J Infect Dis.2008，197(S2)：S147-S151.)使用VZV感染的细胞膜蛋白裂解物作为捕获抗原，建立间接ELISA方法检测血浆中VZV特异性免疫球蛋白的含量，虽然与金标准膜抗原免疫荧光法(fluorescent antibody to membrane antigen，FAMA)相比具有很好的一致性，但仍存在与其它人疱疹病毒特免交叉反应的可能性。因此，建立可靠的血清学检测方法，提高检测体系的特异性，避免交叉反应，对于临床VZV感染的诊断及高通量抗VZV特异性免疫球蛋白的筛选具有重要意义。

由于间接ELISA反应体系的灵敏性与捕获蛋白的包被浓度有关，而特异性与包被蛋白的抗原决定簇有关，因此，选择病毒特异性的抗原决定簇是提高抗VZV特异性免疫球蛋白检测特异性的关键。

已知VZV为双链DNA病毒，包括125000个碱基对，全部碱基序列已由Davison等人确定，并公开发表(Davison AJ，Scott JE.The complete DNA sequence of Varicella-Zoster Virus.J gen Virol.1986，67：1759-1816.)。该基因组中至少存在着72个ORF，编码33种VZV特有蛋白和13种糖蛋白，其中已发现gE(gpⅠ)、gB(gpⅡ)、gH(gpⅢ)、gI(gpⅣ)、gC(gpⅤ)和gL(gpⅥ)等6种糖蛋白共同存在于病毒囊膜表面和感染细胞的膜表面。

糖蛋白E对于病毒复制是必不可少的，同时也是感染细胞膜表面以及成熟病毒囊膜表面存在的最丰富的糖蛋白，高度保守，其作为候选亚单位疫苗的研究表现出良好的抗原特异性和抗体结合性。由于野生型VZV gpE的蛋白分子包括有四个区域，即信号肽(aa1-24)、胞外区(aa25-539)、跨膜区和胞内区(aa540-624)，而E蛋白的3个抗原决定簇均分布在胞外区(Grose C.Glycoproteins encoded by varicella-zoster virus：biosynthesis，phosphorylation，and intracellular trafficking.Annu Rev Microbil.1990，44：59-80.)。

由于采用单抗亲和层析法，从VZV感染细胞的裂解物中提取足量的gpE需要大量的人力、物力资源并且代价较为昂贵，如果能利用基因重组技术对相应的抗原进行重组表达则可避免上述方法的缺点。