[发明专利]一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒

权利要求书

1.本发明为一种乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，采用磁珠法提取400μl～1ml体积样品中的HBV和内参照核酸为模板，并基于荧光PCR技术完成HBV核酸定量检测；试剂盒包含核酸提取试剂、扩增试剂、定量校准品、对照品和内参照。

2.如权利要求1所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，磁珠法提取和荧光PCR检测HBV核酸的步骤为：取400μl～1ml血清或血浆样品，加入等体积裂解缓冲液、5μl内参照、20μl磁珠混合保持10min；磁吸1min后弃上清，在磁珠中加入800μl清洗缓冲液W1，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入800μl清洗缓冲液W2，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入100μl洗脱缓冲液，混合5min，磁吸1min后取洗脱的核酸20μl加入30μl PCR反应液做荧光PCR检测。

3.如权利要求1所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒核酸提取试剂部分包含裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1、清洗缓冲液W2、洗脱缓冲液，其中裂解缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、4～6M盐酸胍、1～5％(w/v)SDS、10～30％(v/v)Triton X-100，清洗缓冲液W1含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、30％乙醇，清洗缓冲液W2含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、80％乙醇，洗脱缓冲液含有1～10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液。

4.如权利要求1所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒核酸扩增试剂部分包含PCR缓冲液、HBV引物探针、Taq酶，每个测试分别取PCR缓冲液15μl、HBV荧光探针10μl、Taq酶5μl以及模板20μl共50μl反应体系进行扩增反应，由此组成的反应体系中含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.2mM dNTPs、1.5～5mM MgCl₂、各0.2～0.5μM HBV引物和HBV荧光探针以及内参照荧光探针、1～5U Taq DNA聚合酶和0.01～1U UNG酶。

5.如权利要求1所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒扩增部分中的引物探针包含有一对HBV特异性引物、一条HBV荧光探针和一条内参照探针，且一对引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列；HBV荧光探针具有SEQ ID NO：3序列且其5’端标记FAM荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团；内参照荧光探针具有SEQ ID NO：4序列且其5’端标记HEX或JOE或VIC荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团；引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85％以上的序列。