[发明专利]一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒。

背景技术

我国是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染和传播发病的大国，近年来在我国一直呈高发趋势，严重危害人民健康，临床上HBV核酸的荧光定量PCR检测是预防、诊断HBV感染和评价治疗效果的有效手段。

HBV核酸荧光定量PCR检测首先需要进行样品核酸提取，目前国内外临床应用的核酸提取方法主要有：(1)碱裂解煮沸法，或同时先进行多聚糖浓缩沉淀HBV病毒，在沉淀中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅胶膜吸附柱法，采用硅胶膜层析柱吸附、清洗、洗脱获得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脱获得核酸。磁珠吸附法具有提取的核酸纯度、效率较高的优点，且相对于传统的碱裂解煮沸法更适合于自动化操作，是未来病原体核酸提取的发展方向。另一方面，在HBV荧光PCR检测中需要防止结果的假阴性和假阳性，提高检测准确性，前者可以通过引入内参照监测样本提取过程中的误操作与核酸丢失、反应中的PCR抑制物作用，从而避免检测结果假阴性；后者可以在扩增体系中使用脱氧尿嘧啶核苷酸-尿嘧啶糖基化酶系统(dUTP-UNG)，降解扩增产物引起的污染，减少检测结果假阳性。

目前临床上已经有一些HBV核酸定量检测产品上市应用，采用碱裂解煮沸方法提取样品HBV DNA者居多，也有采用硅胶膜吸附柱法和磁珠法提取，但所取的样品在50～200μl之间、体积偏少，同时没有使用内参照，结合荧光PCR技术检测后存在结果准确性和灵敏度不足的缺点，试剂盒质量需要改进和提高。针对这些问题，本发明采用磁珠法提取大体积样品中核酸，并在荧光PCR检测时应用竞争性内参照和dUTP-UNG酶防污染系统，减少检测结果的假阴性和假阳性，提高检测的准确性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，采用磁珠法提取400μl～1ml大体积样品中的HBV和内参照核酸，并经荧光PCR定量检测，采用的竞争性内参照和dUTP-UNG防污染系统可以减少检测结果的假阴性和假阳性，从根本上解决了现有方法存在的检测准确性差、灵敏度低的不足，适合在临床HBV核酸定量检测中应用。

技术方案

本发明的技术方案为：

一种HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，其特征在于，采用磁珠法提取400μl～1ml体积样品中的HBV和内参照核酸为模板，并基于荧光PCR技术完成HBV核酸定量检测。试剂盒包含核酸提取试剂、扩增试剂、校准品、对照品和内参照，对照品包括阴性对照和临界阳性对照。

所述的HBV核酸定量检测方法与试剂盒，其中磁珠法提取和荧光PCR检测HBV核酸的步骤为：取400μl～1ml血清或血浆样品，加入等体积裂解缓冲液、5μl内参照、20μl磁珠混合保持10min；磁吸1min后弃上清，在磁珠中加入800μl清洗缓冲液W1，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入800μl清洗缓冲液W2，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入100μl洗脱缓冲液，混合5min，磁吸1min后取洗脱的核酸20μl加入30μl PCR反应液做荧光PCR检测。

所述的HBV核酸定量检测试剂盒，其核酸提取试剂部分包含裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1、清洗缓冲液W2、洗脱缓冲液，其中裂解缓冲液含有50mMTris-HCl(pH8.0)、4～6M盐酸胍、1～5％(w/v)SDS、10～30％(v/v)TritonX-100，清洗缓冲液W1含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、30％乙醇，清洗缓冲液W2含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、80％乙醇，洗脱缓冲液含有1～10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液。

所述的HBV核酸定量检测的方法与试剂盒，核酸扩增试剂部分包含PCR缓冲液、HBV引物探针、Taq酶，每个测试分别取PCR缓冲液15μl、HBV荧光探针10μl、Taq酶5μl以及模板20μl共50μl反应体系进行扩增反应，由此组成的反应体系中含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.2mM dNTPs(包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP等比例)、1.5～5mM MgCl₂、各0.2～0.5μM HBV引物和HBV荧光探针以及内参照荧光探针、1～5U Taq DNA聚合酶和0.01～1U UNG酶。