[发明专利]用于校正共聚焦扫描显微镜中的图像失真的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于确定(identify)用于操作共聚焦扫描显微镜扫描单元的扫描坐标值或者校正扫描坐标值的方法。本发明还涉及一种借助于共聚焦显微镜来创建样本图像的方法。

背景技术

共聚焦扫描显微镜能够用来例如激发样本特别是组织样本中的荧光物质，并检测由此产生的荧光。其原理在于，照射光束经由扫描单元引导到样本上，扫描单元根据包含扫描坐标值的驱动信号来操作。该扫描坐标值表示扫描单元的定位元件的位置。从样本中发出的荧光经由扫描单元以及从照射光中分离该荧光的分束器引导到检测针孔，该检测针孔允许小部分检测光(detected light)通过而到达检测器。借助于检测器所测出的检测光根据扫描坐标值而被检测。换句话说，除了扫描单元所检测的信号，还记录在对检测光的检测中扫描单元的定位元件所处的位置，该位置是由扫描坐标值表示的。

检测光能够根据用以驱动扫描单元的扫描坐标值而被检测；如果扫描单元(特别是它的位置)是以闭环方式控制的，那么也能够将该预定义扫描坐标值称为“目标”扫描坐标值。或者，扫描单元的真实位置能够借助于传感器测出，然后就能够将这些测出的扫描坐标值与在该测出位置所检测到的检测光关联起来；再者，如果扫描单元的位置是以闭环方式控制的，那么也能够将这些测出的扫描坐标值称为“实际”扫描坐标值。

在样本的光学扫描期间或者之后，样本的图像能够基于许多的采集像点组合而成，每个像点的位置是由一对图像坐标值确定的，并且相应的扫描坐标值是关联到图像坐标值的。通过近似法确定图像坐标值与扫描坐标值的这一关联是已知的。然而，这能够产生失真和/或变形，特别是在样本图像的边缘处。

图像失真的产生不仅仅因为近似计算得到的扫描坐标值，而且因为共聚焦扫描显微镜的光学元件的光学效应，该光学效应在已知的扫描显微镜或者用于操作扫描显微镜的方法中未加考虑。

失真是成问题的，特别是要从多个并置的单个图像组成成样本的整个图像的时候，因为此时图像在它们的边缘处彼此并不匹配。此外，在将以共聚焦方式获取的样本的图像叠置于宽视场图像上时，这可能更成问题，因为在图像边缘处的这种失真对于宽视场成像不会产生，而样本的两幅图像在一起不会适配，尤其是在图像的边缘处。

发明内容

本发明的目的是建立一种用于确定用于操作共聚焦扫描显微镜的扫描单元的扫描坐标值或者校正扫描坐标值的方法，或者一种借助于扫描显微镜来创建样本图像的方法，其能够利用简单的手段创建样本的精确图像，特别是在图像边缘处。

该目的通过独立权利要求的特征来实现。有利的实施例出现在从属权利要求中。

根据第一方面，本发明特征在于：通过笛卡尔图像坐标值到球面坐标系统的坐标转换，根据样本的要创建的图像的像点的笛卡尔图像坐标，确定球面扫描坐标值。根据该球面扫描坐标值来操作该扫描单元。

笛卡尔图像坐标值到球面坐标系统的转换有助于样本的图像的像点(其通过对检测光的检测来确定)与共聚焦扫描显微镜的扫描单元的位置之间的精确关联，扫描单元的该位置由球面扫描坐标值来预定义。这得到了这样的结果：样本的图像精确地对应于样本，特别是在图像的边缘处。

球面扫描坐标值以一定格式存在，或者被格式化，以使扫描单元可根据球面扫描坐标值来操作。就这一点来说，其意即，将球面扫描坐标值保存在关联明细例如表格中，之后将该关联明细存储在扫描显微镜的控制单元的存储单元中，并且在共聚焦扫描显微镜的工作期间由控制单元读出。调制驱动信号，以使扫描单元的定位元件居于与球面扫描坐标值对应的位置。或者，能够将球面扫描坐标值正好以如下方式格式化，即，它们已经作为驱动信号、例如调制过的而存在(无需转换)；并且将这些例如以数字化方式存储在控制单元的存储单元中。在每种情形下，扫描单元的位置指的都是，借助于扫描单元而偏转的照明光束与在扫描单元参考位置时借助于扫描单元而偏转的参考光束形成的夹角。

在有利的实施例中，当确定该球面扫描坐标值时对扫描显微镜的不同的变焦步进(zoom step)加以考虑。“变焦”指的是区域或者坐标区域的极限。变焦步进对应于放大率步进，并且也能够这样称呼它。就此而言，如果该不同的变焦步进是通过将像点彼此之间的间隔预定义为与变焦步进相关来加以考虑的，那么这是特别有利的。对变焦步进加以考虑使得总是可以保证以后操作扫描显微镜时图像创建有相同的精度，而不管变焦步进如何。