[发明专利]以PAC-PB1N复合物为靶点的抗流感病毒抑制剂的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗流感病毒物质的筛选方法及其应用，具体通过酶联免疫吸附和高通量药物筛选的体系，以禽流感病毒PA亚基C端(PA_C片段)-PB1亚基N端(PB1_N片段)复合物为底物对中药提取物进行抗流感病毒的活性筛选，并由此得到具有活性的中药提取物丁香、老鹤草、血见愁或余甘子等。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见的急性呼吸道传染病，以冬春季多见，临床以高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状重而呼吸道其它症状较轻为特征。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。近年来，由属于甲型病毒的H5N1亚型禽流感病毒导致的禽类与人的疫情的广泛传播对人类健康造成了全球性的重大威胁，最近，墨西哥爆发了甲型H1N1流感并传播到全球数十个国家，进一步加剧了这种威胁。由于流感病毒的高速变异和进化，使得传统的疫苗很难对未来的流感疫情具有针对性，并且流感病毒本身也不断对目前已有的药物产生抗药性，因此开发新型抗流感药物已成为各国极为迫切的重大课题。

目前，针对流感的疫苗和药物主要针对的是流感病毒包膜上的HA受体、NA神经氨酸酶、M2离子通道，而这些蛋白由于突变较快，能很快产生抗性。相比之下，作为流感病毒RNA聚合酶三元复合物的PA、PB 1和PB2亚基，由于一方面在流感病毒基因组转录和复制过程中具有非常重要的生物学功能，其中PB 1亚基具有聚合酶和核酸内切酶活性，PB2亚基负责帽结合，PA亚基涉及RNA复制和蛋白水解活性，PB1能与PB2或PA形成二元复合物，但PB2和PA则无法形成复合物，所述复合物均在流感病毒基因组转录和复制中起重要作用；另一方面在整体氨基酸序列尤其是活性位点处具有高度的保守性。因此使得上述亚基尤其是PA亚基成为一个非常理想的新型药物设计和筛选的靶标。

2008年下半年以来，生物物理所刘迎芳研究院课题组和饶子和院士领导团队联合解析了禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1))PA亚基C端(PA_C片段)-PB1亚基N端(PB1_N片段)复合物和以及PA亚基N端(PA_N片段)两个部分的晶体结构，并对其功能也做了相应的研究。禽流感病毒的PA_C片段与PB1亚基的N端25个氨基酸被证明具有很强的特异性相互作用，能够在体外形成非常稳定的二元复合物(参见图1)，这对于RNA聚合酶三元复合体的顺利组装并且发挥聚合酶活性具有重要意义。同时，也有文献报道在细胞内单独表达的PB 1N端25个氨基酸的小肽能有效抑制禽流感病毒在细胞内的复制，这说明PA_C是与PB1相互作用的主要部位。如果能够用小分子将PA_C片段中负责与PB1结合的口袋部位屏蔽，将会有效阻止RNA聚合酶三元复合物的组装，从而直接抑制了禽流感病毒在宿主细胞内的转录和复制。因此，本发明根据PA_C片段的这一性质，以阻断PA_C片段-PB1_N复合物的形成作为本发明药物筛选的直接对象和目标之一。

天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。传统中药是本发明中华民族几千年来在治疗各种疾病过程中积累的宝贵的知识财富，很多常见的疾病在中医理论中都有针对的药方存在；同时，中药中存在的天然生物活性小分子的种类和数目是极其庞大的，本身也是一个非常丰富的小分子药物库，其中有非常多的小分子是传统的化工合成所不能合成的。因此，使用天然产物提取物如中药提取物作为本发明药物筛选的平台，具有传统的药物筛选平台所不具有优点，同时也有利于发展我国的中药事业，赋予其更加科学的理论基础。