[发明专利]一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法

权利要求书

1.一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养诱导甘草无菌苗：取成熟的甘草种子，用消毒液消毒灭菌，然后将无菌种子接种到萌发培养基上，经过培养得到甘草无菌苗；

(2)利用无菌苗颈段诱导愈伤组织：切取上一步得到的无菌苗颈段，接到愈伤组织诱导培养基中，每28天继代培养1次，连续继代培养3次得到稳定的愈伤组织；

(3)甘草悬浮细胞的诱导：挑选形状松散、颜色浅的愈伤组织诱导悬浮细胞，经挑选，继代培养得到稳定高产的细胞系；

(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器的培养：挑选稳定高产的细胞系，利用自行研发设计的鼓泡式生物反应器培养，得到成熟的甘草细胞；

(5)甘草多糖的提取：用水提醇沉法提取步骤(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。

2.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)甘草无菌苗的诱导方法为：挑选颗粒饱满，呈深绿色的甘草种子，用5％～15％的次氯酸钠在磁力搅拌器上对种子进行搅拌灭菌，转速为200r/min～500r/min，温度为20℃～30℃，灭菌时间20min～40min，MS培养中含2％-5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，接种在含MS固体培养基的三角瓶内，放在20～28℃光照培养箱中，培养30～35天，得到甘草无菌苗。

3.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)甘草愈伤组织是从甘草无菌苗下胚轴诱导得来，经多次筛选继代后，生长状态稳定；愈伤组织继代培养基为MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，继代周期25～30天。

4.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)甘草悬浮细胞培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，初次培养3～5天后，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，悬浮细胞每隔15～20天继代一次；摇床转速110～120r·min^-1，培养温度(20～28)℃；经过数次传代筛选，最终获得性能优异的细胞系。

5.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器培养是指：利用自行设计的5L鼓泡式反应器，接种量为5％～10％的鲜重甘草细胞，发酵罐通气量为200L/min～500L/min，培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，PH值为5～9，培养周期为15～20天。

6.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(5)甘草多糖的提取是指：取甘草细胞粉末，加入15～25倍重量的蒸馏水，静置5～12h，水浴1～5次，每次1～3h，重复水浴2～5次，合并滤液，浓缩到一定体积，以无水乙醇调制终浓度为50～90％，0～6℃静置过夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。