[发明专利]一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，具体的说涉及一种甘草细胞培养生产甘草多糖的方法。

背景技术

甘草作为一种传统中药，自古以来就有“十方九草”的美誉，甘草多糖是甘草中三大主要活性成分之一。甘草作为我国常用的大宗药材，国家二级保护植物；是国家专控药材，甘草中有效成分，生物活性强，应用广，价格高，市场需求日益强劲，而野生甘草种子出芽率低，加上掠夺性开采；供求矛盾日益严重；沙漠严重，利用组织培养技术生产甘草活性成分具有广阔的发展前景。自本世纪初，利用植物细胞，组织和器官培养的方法生产药用活性物质的研究取得了惊人的进展，已有近1000种植物进行过细胞培养方面的研究，据估计，已经从400多种植物中建立了组织和细胞培养物，并从中分离出600多种代谢产物，甘草悬浮细胞生产出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节活性，具有很强的免疫调节、抗疲劳的作用，具有广阔的开发前景。甘草细胞悬浮培养，利用本实验室自行研发的一种适合细胞悬浮培养的生物反应器，中国专利申请号201110255311.9发明名称：一种植物组织培养用鼓泡式生物反应器。同时经对现有技术文献的检索发现，中国专利申请号200810040456.5，发明名称为：利用组织培养生产大豆异黄酮的方法的专利中公开了一种利用大豆愈伤组织生产大豆异黄酮的方法，该方法的成功为组织培养技术生产目的产物提供一种可能。目前甘草资源缺乏，通过细胞培养方式生产甘草多糖具有广阔前景，并还未见报道。

发明内容

为了现有技术中的问题，本发明提供了一种甘草细胞培养生产甘草多糖的方法，解决目前甘草资源缺乏的问题。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，包括如下步骤：

(1)培养诱导甘草无菌苗：取成熟的甘草种子，用消毒液消毒灭菌，然后将无菌种子接种到萌发培养基上，经过培养得到甘草无菌苗；

(2)利用无菌苗颈段诱导愈伤组织：切取上一步得到的无菌苗颈段，接到愈伤组织诱导培养基中，每28天继代培养1次，连续继代培养3次得到稳定的愈伤组织；

(3)甘草悬浮细胞的诱导：挑选形状松散、颜色浅的愈伤组织诱导悬浮细胞，经挑选，继代培养得到稳定高产的细胞系；

(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器的培养：挑选稳定高产的细胞系，利用自行研发设计的鼓泡式生物反应器培养，得到成熟的甘草细胞；

(5)甘草多糖的提取：用水提醇沉法提取步骤(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。

所述步骤(1)甘草无菌苗的诱导方法为：挑选颗粒饱满，呈深绿色的甘草种子，用5％～15％的次氯酸钠在磁力搅拌器上对种子进行搅拌灭菌，转速为200r/min～500r/min，温度为20℃～30℃，灭菌时间20min～40min，MS培养中含2％-5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，接种在含MS固体培养基的三角瓶内，放在20～28℃光照培养箱中，培养30～35天，得到甘草无菌苗。

所述步骤(2)甘草愈伤组织是从甘草无菌苗下胚轴诱导得来，经多次筛选继代后，生长状态稳定；愈伤组织继代培养基为MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，继代周期25～30天。

所述步骤(3)甘草悬浮细胞培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，初次培养3～5天后，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，悬浮细胞每隔15～20天继代一次；摇床转速110～120r·min^-1，培养温度(20～28)℃；经过数次传代筛选，最终获得性能优异的细胞系。

所述步骤(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器培养是指：利用自行设计的5L鼓泡式反应器，接种量为5％～10％的鲜重甘草细胞，发酵罐通气量为200L/min～500L/min，培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，PH值为5～9，培养周期为15～20天。