[发明专利]一种基于海洋青鳉卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环境污染检测领域，涉及一种基于新型广盐性模式鱼类卵黄蛋白原的水体环境雌激素污染检测方法，可广泛运用于滨海城市内湖，河流入海口，海水等区域的环境雌激素污染程度评估。

背景技术

目前，针对环境雌激素的污染问题主要采用化学检测的方法，如液相色谱和质谱联用法（HPLC-MS）等。这些方法的优点是灵敏度高，但这些方法所需的分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。另外，这些方法对样品的要求较高。环境样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。与化学方法相比，生物检测可以避开成分检测，直接分析污染样品引起的生物学效应，可更直观的反映环境污染的危害程度。但目前的生物检测法尚处于初始发展阶段，极少有海水小型模式动物运用生物学检测。因而有必要开发基于海水生物活体模型的检测技术，从海水的综合生物学和毒理学活性来直接评估海水污染的健康危害程度。我们选择了新兴模式生物－海洋青鳉鱼。

海洋青鳉（Oryzias melastigma 或 Oryzias dancena），又名印度马达卡（Indian medaka），黑点青鳉，原产于巴基斯坦、印度、缅甸和泰国沿海及淡水水域。在分类学上，海洋青鳉与日本青鳉同属脊索动物门辐鳍鱼纲颚针鱼目怪颌鳉科青鳉属。海洋青鳉鱼作为近海海洋环境雌激素活体检测模型具有以下优势：1. 体型较小，耐受力较强，很容易在实验室大规模饲养。2. 性别差异可通过鱼鳍形态的不同而快速辨别。3. 雌鱼产卵量大，世代周期短，繁殖代数多。4. 对盐度的适应范围宽泛，可开发成有别于淡水斑马鱼模型的活体检测模型，在各种盐度的环境条件下进行推广应用。

鱼类卵黄蛋白原特异性产生于雌性动物肝脏中，正常条件下，雄鱼或者幼鱼体内很难检测到表达，但在雌激素暴露下，雄性也会产生应激而表达卵黄蛋白原。因而，雄鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染（Sumpter, J.P. and Jobling, S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environ Health Perspect）。目前国内外已针对卵黄蛋白原开发出类雌激素检测方法，但所选择的鱼类模型均为淡水鱼类，包括鲤科和鲟科鱼类（如专利公开号：CN101519650 和CN1763090）。通过查阅文献（中国期刊网、中华人民共和国专利局专利检索、Science Direct、ISI Web of Science、Springer Journal、NCBI，等），未见海水鱼类用于环境雌激素的检测方面的专利报道。本研究选用广盐性海洋青鳉鱼作为活体模型，建立了针对卵黄蛋白原的活体环境雌激素检测技术，具有较高的创新性和实用性。

发明内容

本发明的目标是提供一种检测各盐度条件下的环境雌激素污染的检测技术，并运用于海域的环境雌激素污染检测。我们首次将新型模式物种—海洋青鳉鱼（Oryzias melastigma）作为该项技术的鱼类模型。方法上采用实时荧光定量PCR方法，检测性成熟雄鱼在环境样品暴露下，卵黄蛋白原（vitellogenin, VTG1）mRNA表达水平的变化情况，进而指示样品的雌激素污染。

采用SYBR实时定量PCR方法检测VTG1的表达，并以18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA）为内参基因，建立了VTG1转录水平的检测体系，包括引物的设计，主要采用primer3.0初步设计引物，用Oligo6.0进一步筛选引物，进行PCR实验，对引物的特异性和扩增效率进行评估，最终优化获得VTG1和内参基因18S的定量PCR用引物各一对，序列如下：

VTG1荧光定量PCR引物：

F: 5’-TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3’；

R: 5’-GGAAATGCAGGACACCCCAGTAGCC-3’；

18S荧光定量PCR引物

5’-AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3’；

R: 5’-AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3’。