[发明专利]一种高灵敏量子点免疫渗滤荧光定量检测方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种基于量子点的免疫渗滤荧光定量检测方法，可实现病原体、重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、毒品检测、药品和食品安全等目标被测物的定量检测，属于荧光检测技术领域。

背景技术

免疫渗滤(IFA)是一种在临床检验中常见的方法，其基本原理是：以一硝酸纤维素(NC)膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。免疫渗滤实验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的，应用的结合物是酶标记的。渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约为0.4～0.8cm的小圆吸孔，盒内垫放吸水塑料，NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下，紧密关闭盒盖，是NC膜片贴紧水塑料。如此即制备成一渗滤装置。20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的金免疫渗滤实验(GIFA)，省却了酶对底物的反应，更加简单、快速。

免疫金标记技术利用胶体金大量聚集而显色，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这种方法具有快速、简便、准确等优点，在检测抗原、抗体中得到了广泛使用。免疫胶体金在医学检验中最常用的有免疫胶体金斑点渗滤试验和免疫胶体金层析试验两种方法。相比较而言，由于免疫胶体金与样本中被测物之间的呈色标记反应在均相介质中进行，使反应充分，故免疫胶体金斑点渗滤技术具有非常敏感、非常可重复，快速又简便等特点，是发展敏感度和准确性更好的金标法快速斑点渗滤定量检测诊断试剂盒的前提。

中国专利200710044730.1提供了一种快速、简便、准确的快速定量检测C-反应蛋白的胶体金法。反应原理为固相双抗体夹心法的金标免疫斑点渗滤试验，样本经40～480倍稀释后与免疫胶体金在液相均质介质中混和均匀，再转加到反应板上，其中所含的、已与免疫胶体金在一起的被测物能为膜上固定的抗被测物另一决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点，斑点色泽与样本中CRP浓度旱正比。

量子点(Quantum dots，QDs)又叫半导体纳米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素组成的稳定的、尺寸介于1～20nm之间的纳米微晶体，是20世纪90年代发展的一种具有优良光谱特性和光化学稳定性的生物荧光标记物。其具有许多优良的光学特性：(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。CdSe/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达10⁶L/(mol·cm)，且荧光量子产率高(50～80％)，因而可产生较强荧光信号。(5)量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20～50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针，在荧光免疫分析和多组分检测、免疫示踪分子定位、纳米生物传感器、实时检测、细胞成像、体内成像、疾病诊断等方面具有独特的作用和广泛应用前景。根据文献报道，量子点作为新一代生物荧光标记物，具有取代传统有机染料的潜力。

相比于荧光检测，胶体金定量在灵敏度和线性范围上均有不足。而量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫渗滤检测方法，对被测物进行高灵敏定量检测。本方法只需改变量子点的粒径或种类，就可得到不同波长的荧光，用不同类型的量子点标记不同的抗体，可产生多色荧光，实现多组分的检测，方法简单快速，灵敏度高。因此，需要一种方法使量子点应用于免疫渗滤检测，以克服胶体金定量在灵敏度和线性范围上的不足。

发明内容

本发明针对胶体金免疫渗滤定量技术的不足和缺陷，利用弱荧光层析膜、极弱荧光吸水垫、极弱荧光扣卡等降低荧光背景，利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好、荧光发射波长可调等特性提高荧光信号，提供一种基于量子点的快速免疫渗滤法检测的试剂盒，对被测物进行半定量或定量检测。本发明方法简单、准确、快速、特异、灵敏，成本低，适用于血样、尿样、唾液、粪便等样本，应用于重大疾病(如肿瘤、心血管疾病等)、毒品检测、食品安全等检测，可在医院、海关、机场、家庭等场所使用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：