[发明专利]一种可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体，及其构建方法和应用

权利要求书

1.NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中在载体中含有至少一种配体分子的小干扰RNA结构单元以及任选地阴性对照shRNA寡核苷酸编码序列。

2.权利要求1所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中所述在载体中包含二种配体分子或三种配体分子的小干扰RNA结构单元。

3.权利要求1或2所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中所述配体为Rae1，Mult1或H60。

4.权利要求3中所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中针对Rae1的小干扰RNA序列为SEQ ID NO：1-3的序列；针对Mult1的小干扰RNA序列为SEQ ID NO：4-6的序列；针对H60的小干扰RNA序列为SEQ ID NO：7-9的序列。

5.权利要求1-4中任一项所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中所述的载体是腺病毒穿梭载体或者腺病毒载体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，所述小干扰RNA结构单元含有相应分子的发夹结构小干扰RNA的DNA序列、位于该DNA序列上游的H1.1启动子和位于该DNA序列下游的TTTTTT终止子。

7.根据权利要求6所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其特征在于所述的载体所含的发夹结构小干扰RNA的DNA序列由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义链互补的反义链构成。

8.权利要求1-7中任一项所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体用于制备预防和/或治疗肝炎的药物的应用。

9.权利要求1-8中任一项所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统的构建方法，所述方法包括以下步骤：

A.在腺病毒穿梭质粒中，分别插入Rae1，Mult1，H60的小干扰RNA结构单元以及阴性对照shRNA寡核苷酸编码序列，构建NKG2D单配体RNA干扰载体；

B.设计带酶切粘端的引物，从上述A步骤所构建的单配体RNA干扰载体上分别扩增其shRNA转录单位，包括上游启动子，编码发夹结构小干扰RNA的DNA序列、下游终止子；其中shRNA1的下游引物所引入的酶切位点与shRNA2的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位点与shRNA3的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，如此顺序下去；

C.通过PCR的方法，用以上引物分别扩增得到大量的各配体分子的shRNA转录单位，用相应的限制性内切酶对PCR产物进行切割并回收，进一步用DNA连接酶将酶切后的shRNA转录单位的PCR产物首尾相连，得到NKG2D多配体shRNA转录单位大片段；

D.用限制性酶切酶酶切消化C步骤所得到的NKG2D多配体shRNA转录单位大片段，与同样酶切线性化的腺病毒穿梭质粒连接，构建NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体。

10.权利要求9所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统的构建方法，其中进一步包括下述步骤；

E.用归巢核酸内切酶双酶切D步骤所得到的NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体，回收包括NKG2D多配体shRNA转录单位大片段在内的片段；

F.用相同的归巢核酸内切酶双酶切复制缺陷型重组腺病毒载体，回收腺病毒骨架片段；

G.进一步用DNA连接酶将A步骤和B步骤所得到的回收片段连接起来，得到NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体；

H.线性化NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体，并转染进适合的宿主细胞，在其中包装成具有复制能力的完整腺病毒颗粒。