[发明专利]一种可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体，及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种构建可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体的方法，并将该载体用于治疗polyI:C联合D-GalN诱导的小鼠爆发性肝炎，可取得明显疗效。

背景技术

RNA干扰(RNAi)，是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异的转录后基因沉默现象，这是生物体在长期进化过程中用于控制细胞内特定基因活化以及调节基因活化程度的一种机制。自1998年被发现以来，RNA干扰技术被研究人员用来特异性地剔除或关闭特定基因的表达，得到了广泛的应用并取得了迅速的发展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。小RNA的制备方法主要有5种：化学合成siRNA，体外转录，RNaseIII消化长片段dsRNA，siRNA表达载体和siRNA表达框架。其中，前三种主要都是体外制备siRNAs，而后两种是从转染到细胞的DNA模板在体内转录得到siRNAs，后者由于不需要直接操作RNA，具有更高的转染效率和高稳定性。而这些，都主要集中在编码一个短小干扰RNA的技术层面上。

然而，自然情况下，一个分子通常可以与多个不同配体分子相互作用。比如，表达于天然免疫细胞表面的天然免疫活化受体NKG2D有多种不同的配体分子，在机体受到压力诱导，包括病毒感染，DNA损伤等情况下，这些不同的配体分子在其相应细胞上都会有不同程度地上调表达，通过与NKG2D受体相互作用，引起天然免疫细胞(NK细胞、NKT细胞)的活化，介导早期免疫应答。HBV S抗原转基因小鼠对ConA诱导的急性损伤过度敏感，是由于HBV S抗原转基因小鼠的肝脏实质细胞上NKG2D的配体Rae1和Mult1显著升高，通过与NKG2D相互作用，引起肝脏NK细胞过度活化所造成的(Yongyan Chen，Zhigang Tian，et al.Increased susceptibility to liver injury in hepatitis B virus transgenic mice involves NKG2D-ligand interaction and natural killer cells.Hepatology，Vol.46，No.3，2007)。在polyI:C联合D-GalN诱导的肝脏爆发性损伤中，polyI:C模拟双链RNA病毒感染，引起Kupffer细胞表面Rae1分子表达上调，通过与NKG2D相互作用，促进了NK细胞活化，引起了爆发性的肝脏损伤(Xin Hou，Zhigang Tian，et al.NKG2D-Rae1 recognition between natural killer cells and Kupffer cells in a novel murine natural killer cell-dependent fulminant hepatitis.Hepatology，Vol.49，No.3，2009)。在这些模型中，由于NKG2D配体分子的上调，促进NKG2D依赖的NK细胞活化，从而介导免疫应答和免疫损伤。

目前，实验过程降低这种依赖于NKG2D的免疫损伤，主要是通过抗体阻断和RNA干扰这两种手段。然而，抗体阻断受限于抗体的蛋白质本质，作用时间短，因此需要多次给予，并且代价昂贵。对于RNA干扰手段，由于NKG2D表达于游走性的淋巴细胞上，因此靶向NKG2D分子的RNA干扰，随着淋巴细胞的迁移而失去作用，效果难以稳定。相比较下，RNAi抑制固有细胞上NKG2D的配体分子则更具可操作性。然而，NKG2D受体的配体分子是多样的，包括Rae1，Mult1和H60，这些不同的配体分子都能够和NKG2D高亲和力结合，介导免疫应答。因此，多靶点RNA干扰技术亟待发展。我们构建一个单一载体，能够针对NKG2D不同配体分子同时编码多个小干扰RNA，通过对滞留性肝脏实质细胞上这些配体分子的基因沉默，来封闭NKG2D与它们的相互作用，与抗体阻断相比起来，这种方法不仅封闭效果明显，而且大大延长了干扰时相，降低了抗体的昂贵费用。

发明内容

本发明涉及一种可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体及其构建方法及应用，该方法构建了一种可编码NKG2D的多个配体分子(Rae1，Mult1和H60)shRNA的单一载体，该载体可以进一步构建成具有感染能力的编码NKG2D多配体shRNA的腺病毒或腺病毒穿梭质粒。该载体可同时沉默不同的靶基因，对PolyI:C/D-GalN联合注射引起的依赖于NKG2D的爆发性肝炎有着明显的治疗作用。

本发明的技术方案