[发明专利]去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A、纯化方法及用途

权利要求书

1.去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，其特征是所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A在制备预防肺炎链球菌感染的疫苗的应用。

3.表达权利要求1所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因，其特征是所述表达序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No.3所示；所述表达序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No.4所示。

4.含有表达人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体，其特征是将序列表SEQ ID No.3所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体1；或将序列表SEQ ID No.4所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体2。

5.含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株，其特征是将所述重组载体1导入到大肠杆菌E.Coli BL21中或将所述重组载体2导入到大肠杆菌E.Coli BL21中得到含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。

6.去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，其特征是包括如下步骤：

(1)发酵权利要求4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；

(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH＝8.0 20毫摩尔/升 tris重悬沉淀，匀浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；

(3)批次吸附：将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH＝8.0的20毫摩尔/升tris；以3-5倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH＝5.4的浓度为20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以3-5倍样品体积的含350-450毫摩尔/升的氯化钠pH＝5.4的浓度为20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；

(4)将Elute产物用pH＝5.4的20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；

(5)Q柱准备：以3-5倍的柱体积的pH＝5.4的20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；

(6)上样：将步骤(4)得到的产物上样Q柱；

(7)以3-5倍柱体积的含有50-150毫摩尔氯化钠的pH＝5.4的20毫摩尔/升 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有160-300毫摩尔/升 氯化钠的pH＝5.4 20毫摩尔/升 柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；

(8)将步骤(7)获得的产物以pH＝4.0 20毫摩尔/升 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；

(9)SP柱准备：以3-5倍的柱体积的pH＝4.0 20毫摩尔/升 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；

(10)上样：将步骤(8)获得的产物上样SP柱；

(11)以3-5倍柱体积的含有250-350毫摩尔/升 氯化钠的pH＝4.0 20毫摩尔/升 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有450-550毫摩尔/升 氯化钠的pH＝4.0 20毫摩尔/升 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90％以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。