[发明专利]一种提取高纯度微囊藻毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微囊藻毒素的提取方法，具体为一种从产毒铜绿微囊藻中提取高纯度微囊藻毒素的方法，属于环保技术领域。

背景技术

近年来，随着全球水体富营养化程度的加剧，世界各地有害藻类水华(Harmful Algal Blooms，HABs)事件发生的频率和幅度日趋增加。藻类水华已成为严重影响水环境质量和水体生态安全的全球性问题，不仅极大的危害人类健康和其他生物安全，也给全球造成巨大的经济损失。有些水华藻类在代谢过程中或藻体破裂后向水体中排出藻毒素，给人类健康、水生动物、家禽等带来极大危害。如铜绿微囊藻所产生的微囊藻毒素(Microsystins，简称MC)是一类具有生物活性的环状七肽化合物，近几十年来，国内外动物试验、人群流行病学调查表明微囊藻毒素具有机体肝毒性、促癌、胚胎毒性、遗传毒性、免疫损害等作用。

微囊藻毒素是一类具有生物活性的七肽单环肝毒素，相对分子量在900-1100之间。到目前为止，发现的微囊藻毒素的异构体达60多种，其中存在较多且毒性较大的是微囊藻毒素MC-LR，MC-YR，MC-RR。能产生微囊藻毒素的藻类主要有微囊藻(Microcystis)、鱼腥藻(Anabaena)、颤藻(Oscillatoria)和念珠藻(Nostoc)等。由于MC-LR存在较为普遍，毒性较强，且已分离培养出标准纯品，故现在藻毒素研究常以其为代表性指标，WHO以MC-LR含量为基准推荐饮水藻毒素标准为1.0μg/L。

随着对微囊藻毒素降解研究的广泛开展，科研人员对微囊藻毒素样品的需求量也越来越大，对水体中微囊藻毒素的检测及降解研究已成为水环境领域的一项重要研究内容。

目前只有少数几家国外公司才能购买到高纯度(纯度95％以上)的MC-LR等标准品，价格昂贵(如美国sigma公司500mg标准品价格约3000元)，购买手续繁杂，等候时间过长等因素给研究带来极大的不便。如果实验所需微囊藻毒素样品全部靠进口标准品来完成，也将大大增加实验成本。因此，开发具有自主知识产权的高纯度微囊藻毒素提取方法对于在水环境及卫生领域展开更多关于微囊藻毒素的研究具有重要意义。

中国专利200910033693公开了一种分离、纯化微囊藻毒素的方法，产微囊藻毒素的蓝藻用1∶20～80的溶剂提取，提取液通过SPE柱净化，然后利用恒流泵、C18层析柱、自动部分收集器构成的柱层析系统对微囊藻毒素进行分离纯化，流动相由35～50％水、50～65％甲醇以及0.05～0.1％酸组成。由于甲醇浓度偏低，还有酸的存在会使藻毒素部分降解，塑料或是玻璃容器会对MC有吸附；超声破碎藻细胞使其中的藻毒素和其他物质同时释放，不利于高纯度藻毒素的获得。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取高纯度微囊藻毒素的方法，该方法高效、经济、纯度高，解决了目前微囊藻毒素标准品价格昂贵、获得手续繁杂等问题。

本发明采取的技术方案为：

一种提取高纯度微囊藻毒素的方法，包括步骤如下：

(1)水样预处理：将铜绿微囊藻水样经液氮反复冻融2-4次，以破碎藻细胞，释放胞内微囊藻毒素MC-LR，然后将冻融后的水样离心取上清液备用；

(2)SPE固相萃取柱的预处理、MC-LR的富集与纯化：用甲醇清洗固相萃取柱2-4次，再用超纯水清洗2-4次；向清洗后的固相萃取柱内通入步骤(1)的上清液过柱，过柱完后用甲醇水溶液作淋洗液清洗富集了MC-LR的固相萃取柱，除去杂质；

(3)MC-LR的溶出与浓缩：用100％甲醇作为洗脱液清洗富集了MC-LR的固相萃取柱以洗脱MC-LR，使MC-LR溶出，将溶出的MC-LR-甲醇混合溶液置于旋转蒸发仪，40-60℃，旋转蒸发10-20min。

上述步骤(1)中所述的铜绿微囊藻水样藻细胞浓度约10⁷个/ml，所述的离心在8000-10000rpm速度下离心8-12分钟。

步骤(2)中所述的固相萃取柱为C18固相萃取柱；所述的过柱速度均为5ml/min；所述的甲醇水溶液浓度为10％-20％(v/v)，洗涤1-2次。

本发明的有益效果是：

(1)本专利用的是100％的色谱纯甲醇作流动相，提取效果更好，样品保留更稳定，而且经过旋转蒸发仪浓缩后，藻毒素样品的纯度更高，可提取得到毫克级MC-LR，杂质少，纯度高；