[发明专利]一种在恒温热源下进行聚合酶链式反应的方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚合酶链反应方法及装置。更具体地，本发明涉及基于热对流建立液体自下而上的温度梯度的原理，在液体受热自发进行对流，并在流经不同温度区域时发生相应PCR扩增的方法，以及相应的装置。

背景技术：

聚合酶链反应技术(以下简称PCR技术)，是一种体外快速扩增DNA的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近10⁹倍，PCR是体外大量获得目的DNA片段的方法，便于对核酸分子做进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中，则可以用于传染病的诊断、遗传疾病的检测及产前诊断、法医研究等。美国专利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188号对PCR技术做出了描述。

DNA的扩增在体内是由细胞内有关因子的参与下，双螺旋的DNA分子被解链成2条单链，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物与单链DNA碱基互补配对，形成引物单链DNA复合物；在DNA聚合酶作用下，沿着5’-3’方向，按碱基互补配对原则，在引物3’端开始，逐一将互补的三磷酸脱氧核苷酸接上，最终形成一条新的双链DNA分子。

而DNA分子在体外的PCR扩增模拟了体内的三个步骤：首先，在大约95℃的高温下加热双链DNA样品，双链间的氢键会断裂，使得DNA热分解成两条互补的单链DNA分子，这一过程称为高温解链反应；然后，温度迅速降到大约50-65℃的范围内，在这个温度下单链DNA与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应；退火反应结束后，温度要迅速升高到72℃左右进行延伸反应，在DNA聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的DNA。经过一个这样的过程，原来的一个DNA双链分子就形成了两个DNA分子，增加了一倍。反复进行高温解链-低温退火-中温延伸三个过程，就可以获得数量更多的复制双链，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板。

目前，主流的PCR扩增技术的反应装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，通过金属块的加热、冷却，达到平衡温度后将热通过反应管传递至PCR反应液。这种装置的缺陷是：反应体积较大，即系统通常具有较大的体积和热容，常规PCR完成30个循环一般需要2-3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热通过反应管传递至PCR反应液，因此，PCR难以实现高效和高通量。而为了加快升降温的速度，也使得PCR仪器制造的困难加大，仪器成本大幅度提高。

在此基础上，20世纪九十年代，研究者们开始将微流控芯片技术应用于PCR扩增。微流控芯片技术是近十年来迅速发展起来的一种新的微型分析系统，它采用微加工技术在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡胶材料上蚀刻出微米尺寸的反应管道及分析组件，由于各种分析过程可在微米尺寸的结构中完成，一方面可使珍贵的生物试样与试剂消耗降低到微升生至纳升级，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，实现高通量的检测。PCR装置的微型化不仅降低了PCR样品的消耗量，而且较低的热容量显著提高了系统的热传导效率，使PCR反应速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系统主要有两种形式：微室静态型PCR芯片和连续流动型PCR芯片。前者是传统PCR的微型化，即将反应混合物固定在反应池中，依赖于温度控制装置的温度循环变化进行热循环扩增，由于是传统PCR的微型化，体积和热容减少，因此反应时间大大减少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通过微加工形成逶迤形流路，在一定推动力的作用下，使PCR反应液连续流经三个不同的温区，完成变性、退火和延伸过程，其优点是其反应温度无需来回反复地快速升降。虽然这两种PCR微流控芯片系统能够快速、高效扩增目的DNA片段，并已成功的实现了与毛细管电泳分离，实时荧光检测以及数组芯片杂交等过程的集成化。但前者其实只是传统PCR的微型化，仍没有突破依靠加热、冷却模块来反复升降温的模式，没有彻底解决升降温的耗时长问题；而后者虽然解决了反复升降温的耗时问题，却带来新的问题，即系统通常包含复杂的液体驱动系统，一方面增加了仪器及反应容器制作的复杂性和成本，另一方面操作比较复杂，限制了其广泛应用。