[发明专利]一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列

权利要求书

1.一种转录因子串联结合序列，是由3-5bp的接头序列(Linker)串联的转录因子AP1、AR、BRCA1、CEBPA、CREB1、E2F1、ELK1、ELK4、ESR1、ETS1、EWSR1-FLI1、FEV、FOXA1、FOXC1、FOXD1、FOXF2、FOXI1、FOXL1、FOX03、Fra-1、GATA2、GATA3、GR、HIF1A::ARNT、HLF、HNF1B、HNF4A、HOXA5、INSM1、IRF1、IRF2、JunB、JunD、MAX、MEF2A、MIZF、MYC::MAX、Myf、MZF1 1-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、NR1H2::RXRA、NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBX1、PDX1、PLAG1、PPARG、PR、PXR-1:RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha:RXR-gam、RAR-beta:RXR-alpha、REL、RELA、REST、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5:RFXAP:RFXANK、RORA_1、RORA_2、RREB1、RXR::RAR DR5、RXRA::VDR、SOX10、SOX9、SP1、SPI1、SPIB、SRF、SRY、STAT1、STAT5A、T3R-beta1、TAL1::TCF3、TBP、TEAD1、TFAP2A、TLX1::NFIC、TP53、USF1、WT1-del2、WT1-KTS、WT1I、WT1I-del2、WT1I-KTS、XBP-1、YY1和ZNF354C等DNA结合元件中的一个或多个后得到的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的转录因子串联结合序列，其特征在于：所述转录因子串联结合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.权利要求1或2所述的转录因子串联结合序列在富集分离内源转录因子及其复合物中作为生物素标记的DNA诱饵的应用。

4.一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1或2所述的转录因子串联结合序列连接入目标载体的多克隆位点中，得到携带有转录因子串联结合序列的重组载体；

2)设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游及下游200bp处退火，以步骤1)中携带有转录因子串联结合序列的重组载体为模板，在所述引物对的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，得到高纯度生物素标记的DNA诱饵；

3)将步骤2)获得的高纯度生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上；

4)内源转录因子的分离纯化：提取细胞核蛋白，将步骤3)获得的固定有DNA诱饵的磁珠与细胞核蛋白进行孵育，洗涤，细胞核蛋白中内源转录因子及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的目标载体为pUC57、pET24a+、pGEX4T-2、pGEX4T-1、pCMV-Myc、pGH或pcDNA-Myc。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中100μl PCR反应体系为：10×ExTaq Buffer 10μl，dNTPs(2.5mM/dNTP)10μl，pUC57-sdTF 1μl(50ng)，上、下游引物各1μl(1nmol)，ExTaq 0.5μl，H₂O 87.5μl；PCR反应条件为：先94℃2min，然后94℃45s，60℃45s，72℃2min，共35个循环，再72℃7min，最后4℃30min。

8.根据权利要求4至7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中细胞核蛋白的提取采用Dounce匀浆的方法，先用低盐溶液破细胞膜，离心分离得到的细胞核经dounce匀浆及高盐溶液溶解，高速离心分离出核蛋白，经BC150透析恢复内源蛋白及其复合物的天然属性。