[发明专利]一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗，其特征在于：甘露聚糖修饰的携带肿瘤相关抗原hTRT基因重组腺相关病毒rAAV能够靶向感染DC细胞，并能获得广谱的抗肿瘤DC疫苗。

2.一种权利要求1所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其具体步骤如下：

(1)获取全长约3.5kb的人源性hTRT基因，构建重组质粒，利用pSH3包装系统制备AAV/hTRT病毒；

(2)病毒AAV/hTRT的甘露聚糖修饰：将纯化后的AAV/hTRT与氧化型甘露聚糖溶液混合，室温孵育过夜；产物保存于-80℃；

(3)Ficoll密度梯度法分离患者外周血单个核细胞(PBMC)；培养3h后保留贴壁细胞，洗去悬浮T细胞并冻存备用；

(4)AAV/hTRT感染贴壁细胞，感染5h后更换为含有GM-CSF(80万U/L)、IL-4(100万U/L)的AIM V培养基诱导DC细胞分化，即获得未成熟的肿瘤相关抗原DC疫苗；

(5)第6天，取冻存的T细胞与培养所得的DC细胞按比例混合，加入GM-CSF(80万U/L)，IL-2(1万U/L)及TNF-α(20μg/L)，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

3.如权利要求1所述的肿瘤相关抗原疫苗，其特征在于：DC疫苗由甘露聚糖修饰的携带hTRT基因的重组腺相关病毒(rAAV)靶向致敏。

4.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于：AAV可定向整合宿主细胞且没有诱发癌变的危险，能使携带的基因长期稳定表达，具有高安全性。

5.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于：rAAV携带的hTRT基因翻译的hTRT蛋白，是一种广谱肿瘤相关抗原，是端粒酶的蛋白亚单位，其表达与端粒酶激活密切相关，在不同类型的肿瘤组织中广泛表达。因此以其制备的瘤苗几乎对所有的肿瘤细胞均产生强大杀伤作用。 

6.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于：使用甘露聚糖修饰rAAV，使其能靶向感染DC细胞；甘露聚糖即甲氨酸甲基化甘露聚糖(chol-AECM-mannan)，是一种被胆固醇部分修饰的多聚糖化合物，易与病毒形成多聚甘露糖复合体，未成熟的DC细胞和巨噬细胞表面高表达甘露聚糖受体，因此可以增加病毒靶向性，提高感染DC细胞效率。

7.权利要求1所述的DC疫苗能刺激产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞CTL，所产生的CTL具有抗肿瘤广谱性，几乎对所有肿瘤细胞具有杀伤作用。