[发明专利]一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，它涉及一种新型树突状细胞(DC)疫苗制备技术。该方法将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，并对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原为广谱肿瘤相关抗原，在几乎所有的肿瘤细胞均有表达，而正常细胞几乎不表达hTRT，因此该DC疫苗刺激的淋巴细胞几乎对所有肿瘤细胞均产生强大杀伤作用，避免了治疗的毒副作用。

背景技术

近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机理的认识以及肿瘤相关抗原的发现及鉴定，以树突状细胞(DC)抗肿瘤疫苗为代表的主动免疫治疗成为肿瘤防治研究的热点。DC是人体内抗原递呈能力最强、唯一能在体内活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者。DC细胞是以主要组织相容性复合物MHC I、II类肽复合物的形式递呈抗原，具有促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中发挥着极其重要的作用。因此被广泛应用于肿瘤疾病疫苗研究。

研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，导致免疫功能低下的原因之一是人体内DC细胞功能的下降。实验证实，从外周血分离出的淋巴细胞仍对多种抗原刺激保持很好的反应能力。因此，通过体外制备DC瘤苗有望成为治疗肿瘤的理想疗法。

如何选择肿瘤抗原并有效地将其导入DC细胞成为问题的焦点。目前肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)，TSA只存在于某种肿瘤细胞，缺乏广谱表达，而TAA在肿瘤组织中广泛表达，能够诱导针对多种肿瘤CTL杀伤效应，故成为肿瘤DC疫苗研究热点。研究发现，人体90％的肿瘤存在端粒酶的活化，被激活的端粒酶在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用，而端粒酶催化亚基(hTRT)是端粒酶的蛋白亚单位，与细胞端粒酶的活性密切相关，也是迄今报道表达最广泛的肿瘤相关抗原之一，因此选择hTRT作为癌症治疗DC疫苗的抗原具有重要价值。

如何能有效地将肿瘤抗原成功加载并导入DC细胞是获得良好活性DC的关键。目前抗原加载常用两种方法：一是抗原肽直接导入DC细胞，二是病毒载体携带抗原基因感染DC细胞。抗原肽直接冲击存在以下不足：(1)抗原肽半衰期短，易降解；(2)目前使用的抗原肽大多来源于细菌表达的基因工程产品，递呈的抗原信息缺乏特异性。而采用病毒携带抗原基因感染DC制备瘤苗可以克服上述不足：(1)抗原基因通过特定的载体转染DC细胞后，可整合于DC染色体内，从而实现抗原基因长期稳定表达；(2)将抗原基因感染DC细胞后，可以在蛋白翻译后做进一步的修饰，保证抗原信息的完整及特异。

目前携带抗原基因感染DC细胞常用的病毒载体有：逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。这三种病毒载体中，AAV用于感染DC细胞更具有优势：(1)AAV全长仅为5kb左右，自身免疫原性低，避免了腺病毒较高免疫原性的缺点；(2)可将携带基因定向整合于人类的第19号染色体上，保证基因长期稳定表达，不存在逆转录病毒载体随机整合易诱发癌变的危险，具有很高的安全性；(3)AAV感染谱广，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞，且能上调DC细胞表面标志CD80、CD83、CD86等的表达，从而上调DC细胞的功能。

研究表明，甘露糖受体(MR)属于C2型凝集素家族成员，是DC细胞和巨噬细胞所特有的膜受体，能有效捕获甘露聚糖糖基化的分子。未成熟的DC细胞表面高水平MR，能识别甘露聚糖修饰的病毒表面上的多种糖分子，介导高效的抗原识别与摄取作用，因此AAV甘露聚糖修饰后对DC细胞具有很强的靶向性，从而大大提高了对DC细胞的感染效率。

综上所述将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，然后对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。经致敏后DC细胞刺激的CTL几乎对所有肿瘤可产生强大杀伤作用，而对正常组织无损伤，该发明制备的以甘露聚糖修饰携带hTRT基因的AAV病毒转染的DC疫苗，具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。

发明内容

本发明要解决的问题是克服现有方法制备的DC疫苗存在体外抗原肽转染DC半衰期较短、转导效率低、靶向性差、活化免疫效应细胞能力弱的缺点。提供一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗及其制备方法。