[发明专利]一种高纯度D-荧光素的制备和纯化方法

说明书

技术领域：

本发明属于化学合成领域，具体涉及一种高纯度D-荧光素的制备和纯化方法。

背景技术：

D-荧光素是一种依赖腺苷三磷酸(ATP)生物发光反应的底物，生物发光的原理是荧光素在ATP和氧存在条件下被荧光素酶氧化，其化学反应式如下：ATP+D-Luciferin+O₂→Oxyluciferin+AMP+PPi+O₂+Light。荧光素/荧光素酶的生物发光反应常用于ATP、能转化为ATP的代谢物(如AMP、ADP、cAMP)和能产生ATP的酶(如肌酸激酶等)的检测，因此生物发光反应可应用于广泛范围内生物材料的检测。近几十年来，ATP生物发光技术得到了很大的发展，已经在细胞增殖、细胞毒性和生物量计数等方面广泛应用。在食品卫生领域由于ATP生物发光技术无需培养过程，操作简便、灵敏度高，数分钟内可得到结果，具有其它微生物检测方法无法比拟的优势，是目前检测微生物最快的方法。除此之外，荧光素酶基因可作为报告基因，在分子生物学上有广泛的应用。因此荧光素/荧光素酶生物发光反应具有很大的市场，D-荧光素作为生物发光反应的底物，随着ATP生物发光反应试剂需求的增加，其需求量越来越大。而D-荧光素目前国内主要依靠进口，其价格高，货期长，另外已有的国产产品含量低，发光活力不高，因此研制高纯度的D-荧光素有很好的市场前景和科学意义。

发明专利ZL200410051705.2，发明名称为D-荧光素化学合成方法及装置相同，介绍了一种新的D-荧光素化学合成方法与装置。通过将高纯度的2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，采用合适的方法提取脱甲基产物2-氰基-6羟基苯并噻唑后经柱层析纯化，最后将纯化的脱甲基产物与D-半胱氨酸进行缩合反应后可获得D-荧光素产品。后续研究发现，随着反应规模的扩大，脱甲基产物2-氰基-6羟基苯并噻唑的纯度有时难以保证，进一步缩合后的荧光素产品纯度和发光活力相对有所降低，纯度不高的荧光素产品因含抑制物发光活力而达不到要求的水平。由于D-荧光素是一种立体异构体，在一些溶剂中容易氧化解旋并见光分解，一般的纯化方法如柱层析纯化效果不好。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备纯度高的D-荧光素产品、且制备的产品D-荧光素的发光比活力高，得率也高的高纯度D-荧光素的制备方法。

本发明的高纯度D-荧光素的制备方法，它是由2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，然后提取脱甲基反应产物，经柱层析纯化，最后将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品，其特征在于，所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品是在充氮气的条件下，2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸在碱性条件下进行缩合反应，反应完毕后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。

所述的将纯化的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素，纯化即得D-荧光素产品，其优选步骤为：纯化后的脱甲基产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑(M176≥85％)与D-半胱氨酸盐酸水合物按质量比1∶1～1.6在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合，用饱和氮气的0.1～2mol/L的碳酸钾溶液在充氮气的条件下，调节其pH至8～9，反应5～60min，反应完毕在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取，水相用0.2～1mol/L的盐酸调节pH至1～3，分离沉淀物，再用体积比为1～5∶1的水和甲醇混合液洗涤沉淀物，10000～15000r/min离心，去上清，沉淀物经真空干燥，即可获得高纯度D-荧光素产品。利用本优选方法制备的D-荧光素产品，其纯度大于90％(HPLC，％Wt)，并且可以高得率获得发光比活力达到甚至高于Singma L9504D-荧光素的D-荧光素产品。

所述的有一定极性的非水溶性有机溶剂优选为醇类、酯类和烃类及其混合物，进一步优选为酯类和烃类，其中所述的在有一定极性的非水溶性有机溶剂中充氮混合中的有一定极性的非水溶性有机溶剂优选为二氯甲烷，所述的用有一定极性的非水溶性有机溶剂萃取中的有一定极性的非水溶性有机溶剂，优选为乙酸乙酯或二氯甲烷或体积比为1∶1的乙酸乙酯和水混合液或体积比1～5∶1的二氯甲烷和水的混合液，萃取优选为2～3次。