[发明专利]一种新的香樟核糖体失活蛋白基因CcRIPII

权利要求书

1.本发明从我国抗病毒病的香樟树中克隆了一种新的核糖体失活蛋白基因CcRIPII。CcRIPII基因不含内函子，但含有完整的ORF区域，其编码序列全长1758个核苷酸(29-1786)，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)(图1)。

2.用pCAMBIA2300为载体构建了CcRIPII的植物表达载体pCAMBIA2300-CcRIPII(图3)，在建成的表达载体中CaMV35S启动子、目的基因、终止子OCS和标记基因NPTII整合在一起构建成嵌合基因，有利于转化和表达。

3.用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣，获得了转基因植株。

4.CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因，我们拥有完全独立自主的知识产权。CcRIPII基因来源于木本植物，因此转化木本植物更容易表达，转基因植株对环境没有不良影响。它的克隆和对林木遗传转化的成功对木本植物抗病毒研究和遗传育种具有重要意义。

5.根据CcRIPII基因序列设计一对特异性PCR引物。

35S-F(5′正向引物)AGG GAT GAC GCA CAA TCC CAC TAT(位于pCABIA2300-35S载体克隆位点的-150bp处)。

GSP3-403R(3′反向引物)CAA TTG CAG GGT CAG GAT TAT CTT CAC GT(此引物的5′位于RIPII基因CcRIPII中间的403碱基的位置)。

PCR产物是550bp。

由于正向引物设计在5′端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3′端，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的CcRIPII基因，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。另外，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为550bp，大小合适，检测方便，效率高。

1)反应液：

2)反应程序

预变性：94℃，5min  

在以下条件下扩增35个循环：变性，94℃45sec；复性，55℃45sec；延伸，72℃，1min；

最后延伸：72℃，5min4℃，保存备用。