[发明专利]一种新的香樟核糖体失活蛋白基因CcRIPII

说明书

一、技术领域

本发明涉及香樟树的一种新的核糖体失活蛋白基因CcRIPII。CcRIPII基因没有内函子，但含有完整的ORF区域，其编码序列全长1758个核苷酸(29-1786)，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。 

构建了CcRIPII基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CcRIPII，用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣获得了转基因植株。CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因，它的克隆和对林木遗传转化的成功，对木本植物抗病毒研究和遗传育种具有重要意义。 

二、背景技术

山东的宁阳大枣是我国著名的优良地方特产，近年来病毒病的流行严重影响了宁阳大枣的发展，造成了重大损失。病毒病不仅对宁阳大枣造成威胁，而且还危害多种果树的生产。泰安市泰山林业科学研究院冯殿齐和刘静研究员发现和宁阳大枣种植在同一地区的一些香樟树对病毒病具有高度抗性。 

核糖体失活蛋白基因(RIP)是一类广谱抗病毒基因，在保护植物免受病毒危害方面具有重要作用。国内外已有不少报道关于RIP基因转化植物、获得抗病毒植物新种质的报道。但是对木本植物的遗传转化迄今尚未见成功报道。本研究希望在这个领域打开个突破口。 

三、发明内容

本发明根据已经报导的植物核糖体失活蛋白基因的保守序列设计PCR引物，经过同源扩增获得了一种新的香樟树核糖体失活蛋白基因CcRIPII的部分序列。然后通过RACE扩增获得了该基因全长cDNA序列(图1)。CcRIPII基因不含内函子，但含有完整的ORF区域，ORF全长1758个核苷酸，编码585个氨基酸和一个终止密码子(TGA)(图1)。随后构建了CcRIPII基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CcRIPII(图3)，用pCAMBIA2300-CcRIPII转化宁阳大枣获得了转基因植株。CcRIPII是国际上克隆并完成对林木遗传转化的第一个木本植物核糖体失活蛋白基因。 

我们用的双元克隆载体pCAMBIA2300(购自公司澳大利亚Cambia公司，其结构见图2)，构建了CcRIPII基因的植物表达载体。在构建目的基因CcRIPII的植物表达载体时，将分子克隆得到的CcRIPII基因片段在SalI和KpnI双酶切位点插入到载体pCAMBIA2300中，建成 的表达载体被命名为pCAMBIA2300-CcRIPII(图3)。所用的标记基因是广泛应用的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性。在构建本表达载体时考虑到融合基因太大会影响表达，因此没包含报告基因GUS. 

由于草本植物和木本植物的结构大不相同，过去RIP基因遗传转化研究用的基因都是来自草本植物，转化的植物也都是草本植物。本研究中我们用来自木本植物的RIP基因转化木本植物，目的基因在木本植物宿主体内更容易表达。 

另外，我们转化中所用的目的基因来自当地的和受体植物生长在同一地区的植物，转化的植物对环境没有任何影响。 

根据CcRIPII基因序列和所用的载体设计了一对特异性PCR引物，正向引物设计在5′端载体序列上，反向引物设计在目的基因的3′端，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的CcRIPII基因，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确性。另外，用这对特异性引物扩增出的PCR产物为550bp，大小合适，检测方便，效率高。 

四、具体实施方式

(一)以木本植物的离体再生体系作为转化材料，利用农杆菌浸染方法进行遗传转化。 

(二)转化操作步骤 

1.农杆菌转化法 

(1)通过三亲株杂交法将pCAMBIA2300-CcRIPII表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，用于农杆菌浸染转化实验。 

(2)菌液制备 

1)用接种环刮拭含有重组质粒的农杆菌菌株冻结的培养物表面，划线于含有相应抗生素的上述YEP平板上，置于28℃恒温培养箱培养2天，待平板上有菌落长出来的时候，即可用于液体培养。长出菌落的平板置于4℃冰箱保存。一个月后转接到新的YEP平板上，以保持菌的活性。 

2)从平板上挑取单菌落，接种于含10ml附加相应抗生素的YEP液体培养基(pH7.0)中，在恒温摇床上，于28℃，180-200rpm振荡培养过夜。