[发明专利]包含突变SPR基因以及野生型TSP基因的细菌宿主菌株

说明书

本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌（E.Coli）。本发明还涉及在此细胞中产生目的蛋白质的方法。

发明背景

通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞可以使得基因通过质粒插入而具有多样的属性。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。

尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括细菌细胞易于在目的重组蛋白质的表达过程中裂解。这种裂解表型可见于野生型细菌细胞，也可见于遗传工程改造的细胞，如细菌蛋白酶缺陷的细胞。蛋白酶在转换大肠杆菌细胞周质和细胞质中老旧、损坏或折叠错误的细胞上起到重要作用。细菌蛋白酶起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常显著降低活性蛋白质的产量。因此，需要降低蛋白酶活性以降低目的蛋白质的蛋白质水解。然而，缺乏蛋白酶如Tsp（也称为Prc）的细菌菌株也表现有细胞裂解。

Tsp（也称为Prc）为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。Tsp（prc）活性降低对降低目的蛋白质的蛋白质水解是可取的。然而，发现缺少蛋白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。Hara等人分离了Tsp缺陷菌株，其为耐热性回复突变株，含有基因外抑制子（spr）突变（Hara等人，Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)）。Spr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp以及外膜中参与细胞分裂中细胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_ECOLI)。携带有突变spr基因的蛋白酶缺陷细菌菌株已在Chen等人（Chen C,Snedecor B,Nishihara JC,Joly JC,McFarlandN,Andersen DC,Batters by JE,Champion KM.Biotechnol Bioeng.2004Mar 5;85(5):463-74）中有描述，其中描述了携带prc（Tsp）及另一种蛋白酶DegP不同突变组合的大肠杆菌菌株的构建，是通过扩增基因上游及下游区域并将其一起连接于包含选择性标记物及spr W174R突变体的载体上产生的。

出乎意料地发现携带突变spr基因及野生型Tsp基因的革兰氏阴性细菌细胞为具有降低的裂解水平的细胞。因此，本发明人提供了新菌株，其具有用于产生目的蛋白质的优势特性。

出乎意料地，根据本发明的细胞显示出优势的生长及蛋白质生产表型，因为已知spr和Tsp为相互抑制子，因此，可以预测如果让其中之一成为主导则细胞可以显示出生长不良的表型，如变得渗漏或更倾向发生细胞裂解。然而，与野生型细胞相比以及包含敲除突变Tsp基因的细胞，本发明的细胞的细胞裂解表型有显著的降低。

发明概述

本发明提供了重组的革兰氏阴性细菌细胞，其包含编码突变spr蛋白质的突变spr基因且其中细胞包含非重组野生型染色体Tsp基因。

在一个实施方式中，除了突变spr基因外，根据本发明的细胞的基因组与野生型细菌细胞基因组是同基因的（isogenic）。

本发明提供的细胞显示出优势的生长以及蛋白质生产表型。

本发明还提供了用于生产目的重组蛋白质的方法，包括在如上文限定的重组革兰氏阴性细菌细胞中表达目的重组蛋白质。

附图简述

图1显示了相比于野生型W3110和MXE001，MXE012和MXE017的生长概况。

图2显示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE012和MXE017中抗-TNFαFab’的表达情况。

图3显示了在抗-TNFαFab’生产发酵期间，W3110和MXE012的生长概况。

图4显示了在抗-TNFαFab’生产发酵中W3110和MXE012（W3110spr H119A）的细胞周质抗-TNFαFab的积累情况（实线及实心图标）以及培养基Fab’的积累情况（虚线及空心图标）。

图5显示了表达抗-TNFαFab’的菌株W3110和MXE012以及表达抗-TNFαFab’及重组DsbC的菌株W3110和MXE012的生长概况。

图6显示了表达抗-TNFαFab’菌株W3110和MXE012以及表达抗-TNFαFab’及重组DsbC的菌株W3110和MXE012的细胞周质（阴影图标）以及上清（空心非阴影图标）中的抗-TNFαFab’产量。