[发明专利]荧光检测方法、荧光微球的制备方法以及荧光微球

说明书

技术领域

本发明涉及利用被荧光色素标识化的荧光微球所发出的荧光识别微球种类的荧光检测方法、被荧光色素标识化的荧光微球的制备方法以及被荧光色素标识化的荧光微球。

背景技术

在医疗、生物领域中所使用的流式细胞仪中，通过向荧光微球照射激光，检测出与活体物质相结合的荧光微球所发出的荧光，根据该荧光，识别该活体物质所结合的荧光微球的探头的种类。在此，在荧光微球中，探头（具有互补序列的基因片段或与特定蛋白质结合的抗体等具有选择性结合功能的物质）设置在表面上。

具体地说，在流式细胞仪中如下形成流动池：在细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质等以被规定的荧光色素标识化的状态下被包括的悬浮液中，作为荧光试剂，混合被可识别的荧光色素染色而被标识化的荧光微球，然后，施加压力使荧光微球在以每秒大约10m速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成流动池。通过朝向该流动池中的荧光微球照射激光，由此接收荧光微球所发出的荧光和与该荧光微球结合的活体物质所发出的荧光。另外，通过将荧光微球的荧光从这些荧光中作为标识进行识别，由此能够特定该活体物质所结合的探头的种类。

尤其是，在不同荧光微球中设置不同种类的探头，以按照不同的探头种类能够用不同荧光色素识别的方式染色荧光微球，由此能够调查活体物质与哪种探头结合的情况。在这种情况下，需要将具有各种探头的多个荧光微球混合到含有活体物质的悬浮液内并在流式细胞仪中短时间内一次性地进行分析。

然而，作为现有技术的荧光检测方法，已公开有利用被荧光色素染色且表面上设有探头的微球所发出的荧光，识别微球种类的方法（专利文献1）。在该方法中，微球被预先对荧光弛豫时间不同的两种荧光色素进行混合的物质染色，利用该微球进行荧光检测时，通过检测微球的荧光并测量荧光弛豫时间，由此识别微球的种类。

专利文献1：特许第4300366号公报

发明内容

通过上述方法，可以认为通过一次测量能够识别数百种微球。但是，并不一定通过一次荧光弛豫时间的测量就能够高精度地识别数百种微球。

为此，为了解决上述问题，本发明目的在于，提供一种荧光检测方法、荧光微球的制备方法以及荧光微球，与现有技术相比，通过一次测量能够高精度地识别多种微球。

本发明的一个方式是，利用被荧光色素标识化的荧光微球发出的荧光识别荧光微球的种类的荧光检测方法，该方法包括如下步骤：利用由使荧光强度、荧光波长以及荧光弛豫时间互相不同的两种基本荧光色素的比率和所述基本荧光色素的绝对含有量设成互相不同的多种合成荧光色素标识化的荧光微球，在多个波段上分别测量荧光强度和荧光弛豫时间的步骤；利用已测量的所述荧光强度、所述荧光弛豫时间以及所述波段的信息，识别所测量的荧光微球的种类的步骤。

例如，当所述基本荧光色素为两种时，将所述基本荧光色素的各个荧光强度设为F₁和F₂，将荧光弛豫时间设为τ₁和τ₂，将所述基本荧光色素的比率设为x（x为小于1的正数）和（1－x），将根据所述绝对含有量确定的常数设为α₁和α₂时，优选的是，所述多种合成荧光色素按照根据下述式（1）确定的合成荧光强度F和根据下述式（2）确定的合成荧光弛豫时间τ相互不同的方式设定所述比率和所述绝对含有量。

F=α₁×τ₁×x+α₂×τ₂×(1-x)             （1）

τ=｛α₁×τ₁²×x+α₂×τ₂²×(1-x)｝/F    （2）

进一步，本发明的一个方式是被荧光色素标识化的多种荧光微球的制备方法，该方法包括如下步骤：荧光强度、荧光波长以及荧光弛豫时间互相不同的至少两种基本荧光色素的比率和所述基本荧光色素的绝对含有量按照与其它种类的荧光微球之间相互不同的方式设定的步骤；由利用所设定的所述比率和所述绝对含有量而得到的合成荧光色素对荧光微球进行标识化的步骤。