[发明专利]用酶从甜菊苷中制备甜菊醇的方法

说明书

发明概述

本发明涉及一种通过使用含有果胶酶的可商购的酶混合物CYTOLASE PCL5使糖苷残基从甜菊苷中裂解而生产甜菊醇的方法。在一些优选的方法中，反应在酵母的存在下进行。

背景技术

Stevia rebaudiana(甜叶菊)含有甜味化合物，即甜菊苷(stevioside)和莱苞迪苷A(rebaudioside A)，它们主要被用作无卡路里的甜味剂。甜菊醇(steviol)是这些化合物的苷元衍生物。甜菊醇可用于改善认知功能；参见例如WO 2009/071277(DSM IP ASSETS，B.V.)。

从甜菊苷中生产甜菊醇很困难。甜菊苷的酸水解很麻烦，因为在酸性条件下，所制的甜菊醇重排变为异甜菊醇。甚至已有多个文献报导不能通过这种方法得到甜菊醇(Kohda等1976 Phytochemistry 15：981-983.)。

Ogawa等1980；Tetrahedron 36：2641-2648描述了一种使用高碘酸钠使甜菊苷裂解来生产甜菊醇的替代方法。然而，该方法需要高度稀释的体系和大量过量(约＞10mol当量)的昂贵的高碘酸钠来实现有用的产率。因此，对于生产大量甜菊醇来说，该方法不经济。

下列文献描述了几种基于酶的方法：

Bridel等1931 Bull.Soc.Chimie Biol.13：781-96指出，甜菊苷不能通过多种“发酵产物”(例如苦杏仁酶、鼠李糖化酶、Aspergillus niger(黑曲霉)或浸软和风干底层的发酵酵母)来水解。作者利用来自蜗牛(Helix pomatia)的淀粉酶制剂获得了成功。然而，他们从每只动物中得到“仅0.5cm³的纯的消化液”，因而不适合大规模生产。Mosettig等1955 J.Org.Chem.20：884-899也通过利用蜗牛的酶制剂(被称为“酶汁”和“干制剂”)使用葡糖苷的酶促水解来制备少量(小于0.5克)的甜菊醇。没有给出酶的进一步特征。

Khoda等在前述文献中报导了其他作者利用粗制的橘皮苷酶从甜菊苷中产生甜菊醇，但重复该方法时，得到莱苞迪苷B和葡萄糖，而不是期望的甜菊醇。

Ruddat等1965 Arch.Biochem.Biophys.110：496-499；Gianfagna等1983 Phytochemistry 22(2)：427-430；以及Pezzuto等1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2475-2482均描述了使用多种可商购的果胶酶(分别为来自Rohm & Haas的″Pectinol 59L″；来自Corning Biosystems的″Pectinol 50L″；来自Rohm & Haas的″Pectinol AC″)的过程。Davis等，1992 Phytopathology 82：1244-50报导了，″Pectinol 59L″不再是可商购的，并且不清楚其他果胶酶是否仍有售。

需要一种从甜菊苷中生产甜菊醇的有效方法，并且该方法适于商业化大规模生产。

发明内容

业已发现，根据本发明的可商购的酶制剂(CYTOLASE PCL5)能使甜菊苷裂解以产生甜菊醇，并且可以被用在高效的、商业上可行的方法中。因而，本发明的一个方面是一种生产甜菊醇的方法，该方法包括：

a)使甜菊苷与CYTOLASE PCL5酶制剂接触，并且

b)回收甜菊醇。

同样业已发现，在裂解期间释放的糖(葡萄糖)可抑制上述酶促反应。因此，优选地，上述反应在酵母的存在下进行。酵母可以除去所产生的葡萄糖，从而使酶促反应可以不受阻碍地进行。因此，本发明的另一方面是一种生产甜菊醇的方法，该方法包括：

a)在活酵母培养物的存在下，使甜菊苷与CYTOLASE PCL5酶制剂接触，并且

b)回收甜菊醇。

附图说明

在整篇说明书中，化合物名称后面出现的数字指的是下列图中所描述的化合物。

图1显示了莱苞迪苷A和甜菊苷的水解。

图2显示了通过Helix pomatia酶和果胶酶使甜菊苷水解。