[发明专利]通过电穿孔技术进行的外源基因转移方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，更特别地，涉及一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法在存活率和基因转移率方面得到显著提高，该方法包括在特定条件下向动物细胞连续地施加第一电脉冲(强电脉冲)和第二电脉冲(弱电脉冲)。

背景技术

基因转移方法被分为两种方法：病毒载体方法和非病毒载体方法。作为用于将外源基因转移至动物的受精卵、血球、皮肤、肌肉、内脏等的细胞内的非病毒载体方法，有多种方法，例如显微注射法、粒子枪法、流体动力法、声致穿孔法(sonoporation method)和电穿孔法。作为用于将外源基因转移至悬浮(培养)细胞(悬浮于溶液中的细胞)的方法，有脂转染法、声致穿孔法和电穿孔法。以外，作为用于将外源基因转移至贴壁细胞(附着于培养皿、孔板等的细胞)的方法，有脂转染法、磷酸法、DAEA葡聚糖法和显微注射法。

在上面的方法中，电穿孔法是一种通过应用高压电脉冲在细胞膜上暂时制造一个微孔，以使外源DNA(例如质粒)可通过该孔并被细胞所接纳的方法。从不同的观点来看，这种方法被高度评价为其中最有利且最多产的基因转移方法。该方法具有多种有利特点，例如对包括植物的多种生物的宽广适用性、高的基因转移率、优异的再现性、更简单的操作、不需要使用特别的试剂以及同时处理许多细胞的可能性。

尽管电穿孔技术的基因转移率仍然较低并且不足，但电穿孔技术与诸如磷酸法等方法相比是更有效的基因转移方法。依赖于细胞种类，电穿孔技术仅达到极低的转移率。

在传统的电穿孔技术中，将从指数输出装置发出的一次电脉冲或从矩形脉冲型电脉冲输出装置发出的一次或多次电脉冲(以固定的恒定较高电压)应用于基因转移。

在使用由指数输出装置发出的一次电脉冲的情况中，不可避免地需要用到如此强的电脉冲，以至于可杀死至少50%的细胞。其基因转移率依然很低，仅仅是存活细胞的1-10%，即使在最好情况中也仅有30%。另外，在使用矩形脉冲型电脉冲输出装置的情况中，需要应用到可杀死至少20%细胞的强电脉冲。其基因转移率依然很低，仅仅为存活细胞的1-15%，即使在最好情况中也仅有30%(见非专利文献1)。

有可能通过应用更强的电脉冲来提高基因转移率，但这影响了细胞的存活率并且严重降低了实际上获得的基因转移细胞的数量。

在使用传统的电脉冲输出装置的电穿孔中，用于电穿孔的专用缓冲液的使用是必需的，这导致高的运行成本。在没有专用缓冲液的情况下，由于极低的效率这些方法不适用。

引用列表

非专利文献

非专利文献1：Biotechniques 第17卷, 第6期 (1994) “Short Technical Report (短篇技术报告)”。

发明概述

技术问题

本发明的一个目的是提供一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法解决了上面的问题，适用于广泛的动物细胞，并且在存活率和基因转移率方面得到非常显著提高。

本发明的另一个目的是提供一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法即使在没有使用专用电穿孔缓冲液的情况下也具有高的存活率和基因转移率。

问题解决

本发明的发明人进行了广泛的研究。结果，发明人发现显著提高的存活率和基因转移率可通过一种通过电穿孔技术将外源基因转移至动物细胞内的方法来实现，该方法包括在特定的条件下连续地施加第一电脉冲(强电脉冲)和第二电脉冲(弱电脉冲)。

发明人还发现甚至在能够被用于培养所述动物细胞的液体培养基被用作电穿孔缓冲液的情况下(在不使用专用缓冲液的情况下)，该方法也允许以高的存活率和基因转移率转移外源基因。

注意到所述方法的可能的原理如下：首先施加第一电脉冲(较强的电脉冲)以在目标动物细胞的细胞膜上制造微孔，从而将核酸转移至该动物细胞内，然后施加第二电脉冲(较弱的电脉冲)，从而进一步地将核酸转移至该动物细胞内并同时积极地恢复细胞膜。

本发明基于上述发现而得以完成。