[发明专利]低度O-糖基化的FGF21的制备方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种制备成纤维细胞生长因子21(FGF21)及其类似物的特殊方法，以及紧密相关的方面。

发明背景

成纤维细胞生长因子是表达于发育中组织及成熟组织中的多肽。它们涉及到数个生理机制，包括例如代谢调节和细胞分化。存在具有超过20种成纤维细胞生长因子的一整个家族(FGF家族)。包括FGF19、FGF21和FGF23的三个FGF家族成员构成了一个亚家族，该亚家族具有涉及代谢调节的内分泌因子的功能。

成纤维细胞生长因子21或FGF-21，这里简称为FGF21，优先在肝脏内表达并且表现出激素样的代谢作用。

数十年来，已经可能重组制备大范围的肽和蛋白质，举例来说在细菌(如大肠埃西氏菌)或酵母(如酿酒酵母)中制备。在酵母中表达的蛋白质经常是被O-糖基化的。在药用蛋白质中，通常应该避免O-糖基化。举例来说，当在酵母中重组制备时，人FGF21被高度O-糖基化。

US 2002/0068325的权利要求1涉及了一种在真菌中生产异源蛋白质的方法，该方法包括提供受体真菌细胞，其中在所述细胞中的质量控制机制被修饰，使得不完全折叠的异源蛋白质在内质网中不被降解；然后将多核苷酸表达构建体引入所述受体真菌细胞内。按照其权利要求8，所述受体细胞在包括选自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6的基因的甘露糖基转移酶基因进行了修饰。所述美国专利申请没有涉及FGF。

发明目的

本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一项缺点，或是提供有用的选择。

本发明的另一个方面涉及提供一种有效制备FGF21及其类似物的方法。

本发明的另一个方面涉及提供一种制备具有低度O-糖基化或没有O-糖基化的FGF21及其类似物的重组方法。

本发明的另一个方面涉及提供一种重组方法，在该方法中FGF21及其类似物的降解被降低。

定义

天然人FGF21蛋白的序列可以从UNIPROT数据库中得到，登录号为Q9NSA1。209个氨基酸的前体蛋白包括信号肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。该成熟人蛋白以SEQ ID NO:1(氨基酸1-181)包含于本文中，该信号肽如SEQ ID NO:2(氨基酸1-28)所示。

本文中提到的术语FGF21的“类似物”，即FGF21类似物，是指一种多肽，该多肽是或者可以是由天然人FGF21蛋白(特别是由SEQ ID NO:1)通过氨基酸序列的修饰所得出或衍生出来的。这样的修饰、修改或改变可包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。被取代、缺失和/或添加的氨基酸的数目总共优选不超过10个，优选不超过8个，更优选不超过6个。举例来说，氨基酸可以在C-末端、在N-末端或在氨基酸序列内部添加和/或缺失。优选氨基酸在C-末端和/或N-末端，更优选在N-末端添加和/或缺失。具有C-末端或N-末端氨基酸缺失的氨基酸序列也可被称为截断序列，正如本领域中已知的。同样地，添加入序列内部的氨基酸可被称为插入序列。术语FGF21类似物指的是具有降葡萄糖作用的化合物。所述降葡萄糖作用可如WO 2010/0841169，尤其是涉及3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的能力测定的实施例8中所描述的来检测。优选地，所述FGF21类似物与人FGF21具有至少90%的同一性，优选具有至少95%同一性。该同一性可如WO2010/084169，尤其是第10和11页所描述的来检测。

这里，术语“PMT”(蛋白甘露糖转移酶)指的是一类酶，该类酶将第一个甘露糖连接在蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基上，产生O-糖基化甘露糖树。然而，并不是蛋白质中所有的丝氨酸或苏氨酸残基都被O-糖基化。PMT家族至少有6种酶(Pmtp1-6)。它们被分为三个亚家族，每一个亚家族以Pmt1p、Pmt2p或Pmt4p来表示。

这里，术语“敲除”指的是可读框的缺失。所述缺失或者可以是可读框的缺失，或者是可读框被标记取代。‘标记’指的是经典酵母遗传学中使用的用于基因缺失以及取代另一基因取代的基因，后者可根据其活性而被选择出来，例如TRP1或KanMX4。

在一个实施方式中，这里涉及的所有的氨基酸和氨基酸残基都是可用核苷酸的三联密码(“密码子”)编码的氨基酸和氨基酸残基，因此相应的FGF21类似物可经重组制备。

这里，术语“PMT1”指的是蛋白甘露糖基转移酶1。

这里，术语“PMT2”指的是蛋白甘露糖基转移酶2。

这里，术语“PMT4”指的是蛋白甘露糖基转移酶4。