[发明专利]与木质素结合降低的碳水化合物结合组件

说明书

技术领域

本发明涉及经修饰的碳水化合物结合组件(carbohydrate binding module)。更具体地，本发明涉及表现出与木质素结合降低的经修饰的第1家族碳水化合物结合组件。本发明还涉及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶、包含编码经修饰第1家族碳水化合物结合组件或经修饰糖苷酶的核苷酸序列的基因构建体，以及包含经修饰的第1家族碳水化合物结合组件的经修饰的糖苷酶在木质素的存在下水解纤维素或半纤维素底物的用途。

背景技术

地球上多于50％的有机碳发现于植物的细胞壁中。植物细胞壁主要由以下化合物组成：纤维素、半纤维素和木质素。这些化合物总称为“木质纤维素”，它们是发酵成乙醇或其他高值产品的糖和其他有机分子的潜在来源。

由于纤维素乙醇在环境方面的有利且可持续的性质，将木质纤维素(或木质纤维素类生物质)转化为乙醇已成为新兴能源政策的关键特征。针对纤维素转化开发了数种技术。本文关注的方法是：对木质纤维素类生物质进行增加其对水解酶的敏感性的预处理，然后使预处理过的木质纤维素经酶促水解成糖并且将这些糖发酵成乙醇或其他高值的有机分子(如丁醇)。常用的预处理方法包括稀酸蒸汽爆破(美国专利No.4,461,648)、氨冷冻爆破(AFEX；Holtzapple等，1991)和有机溶剂萃取(美国专利No.4,409,032)。水解和发酵系统可以是分开的(顺次水解和发酵；SHF)或者同时发生的(同时糖化和发酵；SSF)。在所有情况下，半纤维素和纤维素都被分解成可发酵的糖，同时将木质素分离并且可用作固体燃料或其他有机分子的来源。

经预处理的木质纤维素的酶促水解用纤维素酶进行。术语纤维素酶广义上指催化纤维素聚合物中连接单个葡萄糖单元之β-1，4-糖苷键的水解的一类糖苷水解酶(或糖苷酶)。催化机制涉及内切葡聚糖酶(酶学委员会编号E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)的协同作用。内切葡聚糖酶水解纤维素链中部可及的糖苷键，而纤维二糖水解酶从这些链末端逐步释放纤维二糖。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，并且从而使得纤维二糖水解酶的产物抑制最小化。所述酶共同作为可以水解纤维素底物的系统来运作。

纤维素酶和水解多糖或寡糖的其他糖苷水解酶或糖苷酶通常具有相似的组件结构，其由通过柔性接头肽连接起来的一个或更多个催化结构域和一个或更多个碳水化合物结合组件(CBM)组成。已知许多半纤维素酶(如木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)、甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)和阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55))具有通过柔性接头连接催化结构域与CBM的相似组件结构。半纤维素酶是催化以下键的水解的酶：半纤维素的木聚糖骨架多糖中的糖苷键，或木聚糖骨架中的木糖单元与骨架所连接的其他糖之间的糖苷键。

催化结构域是催化底物中糖苷键水解的独立结构域。已分离和表征了许多糖苷水解酶催化结构域。催化结构域通常(但不一定总是)是两个结构域中较大的一个。将具有相同的三维结构和催化机制(但不一定具有相同的底物特异性)的糖苷水解酶划分为家族(Davies和Henrissat，1995)。迄今为止，已有超过150个糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase，GH)家族。纤维素酶存在于许多GH家族中，包括但不限于第5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74家族；在第5、8、10、11和43家族中有木聚糖酶；在第5、26和113家族中有甘露聚糖酶；在第3、43、51、54和62家族中有阿拉伯呋喃糖苷酶；在第1和3家族中有β-葡糖苷酶。

此外，接头肽是伸长且具柔性的结构，其保持催化结构域相对于CBM的空间定向(Shen等，1991；Receveur等，2002；Boisset等，1995)。不论是细菌还是真菌来源，纤维素酶和半纤维素酶中天然接头肽的长度为6至60个氨基酸不等。这些肽的化学性质和氨基酸组成相似(如果不是具体序列相似)，其中在接头肽的氨基酸中，氨基酸丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸所占比例大于50％(综述见Gilkes等，1991)。接头还包含几个常见类型的带电残基，它们都带负电(如Glu或Asp)或都带正电(如Lys、Arg或His)。丝氨酸和苏氨酸残基可被O-连接聚糖修饰，在真菌中所述O-连接聚糖主要为甘露糖(等，1984)。小角x射线或动态光散射的结果表明，接头肽的糖基化有利于较伸长的构象，其改变催化结构域和CBM的相对位置。