[发明专利]包含突变体SPR基因且具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株

说明书

本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌（E.Coli）。本发明还涉及在此细胞中产生目的蛋白质的方法。

发明背景

通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞的多样属性使得通过质粒进行基因插入。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。

尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括难于产生蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中对于转换老旧、受损或错误折叠的蛋白质起重要作用。细菌蛋白质起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常显著降低活性蛋白质的产量。

已经鉴定出大量细菌蛋白酶。在大肠杆菌中蛋白酶包括蛋白酶III（ptr）、DegP、OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP及lon。

Ts p（也称为Prc）为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一种已知的Tsp底物为青霉素结合蛋白质-3（PBP 3）(Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3of Escherichia coli;Nagasawa H,Sakagami Y,Suzuki A,Suzuki H,Hara H,Hirota Y.J Bacteriol.1989Nov;171(11):5890-3以及Cloning,mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-bindingprotein 3;Hara H,Yamamoto Y,Higashi tani A,Suzuki H,Nishimura Y.J Bacteriol.1991Aug;173(15):4799-813)，但是之后发现Tsp也能够裂解噬菌体尾巴蛋白质并因此重命名为尾巴特异性蛋白酶（Tsp）(Silber等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:295-299(1992))。Silber等人(Deletion of the prc(tsp)geneprovides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12;Silber,K.R.,Sauer,R.T.;Mol Gen Genet 1994242:237-240)描述了一种prc删除菌株（KS1000），其中突变是由以包含Kan^r标志物的片段取代prc基因的片段而产生的。

Tsp（prc）活性降低对降低目的蛋白质的蛋白质水解是可取的。然而，发现缺少蛋白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。Hara等人分离了耐热性回复突变株，其含有基因外抑制子（spr）突变（Hara等人，Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)）。Spr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp以及外膜中参与细胞分裂中细胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_ECOLI)。