[发明专利]纯化免疫球蛋白溶液的方法

说明书

本文报导了从溶液，例如细胞培养上清液或者蛋白质A层析洗脱液中除去宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质的方法，所述方法不需要告知多肽含量。通过将溶液的pH值降低到低于pH 6和在该pH值下温育所述溶液实现此目的。

发明背景

在多种诊断和治疗领域中使用生物学大分子如重组单克隆抗体和其他的蛋白质。特别是单克隆抗体现在被广泛使用在多种严重疾病如癌或者类风湿关节炎中。通常，通过使用细菌、酵母或者哺乳动物细胞的发酵过程产生这些复杂生物学大分子。传统地，通过离心或者过滤从发酵培养液中除去微生物或者哺乳动物细胞，并且之后通过多种方法如过滤、沉淀和层析进一步纯化不含细胞的上清液，以除去与发酵相关的杂质。

除了培养基组分之外，来自发酵过程的主要杂质是来自产生生物学大分子的细胞的残余量的核酸(宿主细胞DNA(HCDNA)和RNA)和宿主细胞蛋白质(HCP)。为治疗目的，在最终的药品中宿主细胞DNA(HCDNA)或者宿主细胞蛋白质的可接受浓度非常低，以减少副作用并且保证患者的安全。在发酵工程中的近来的改进已经导致在生产的生物反应器中较高的细胞密度并且对纯化方法提出了更高的要求，所述较高的细胞密度增加了HCP和HCDNA在无细胞的上清液中的水平。

因此非常希望得到从细胞培养上清液中除去大量的HCDNA和HCP的有效的和廉价的方法。

O’Brien,W.D.,等人(J.Acoust.Soc.Am.52(1972)1251-1255)报导了脱氧核糖核酸水溶液的超声研究。Vorlickova,M.,等人(Nucl.Acids Res.27(1999)581-586)报导了DNA的鸟嘌呤-腺嘌呤重复链的二聚化。Lydersen等人(Lydersen,B.K.,等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.745(1994)222-231)报导了哺乳动物细胞发酵培养液的酸沉淀。在WO 2008/127305中报导了使用低pH和二价阳离子分离生物大分子的方法。在EP1 561 756和EP1 380 589中报导了纯化蛋白质的方法。

发明概述

本文报导了从细胞培养上清液中纯化多肽的方法。已经发现通过调整pH值到酸性范围内并且随后在特定的时间内温育酸化的溶液，宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白质沉淀，但是目的多肽保留在溶液中。之后通过简单的物理分离步骤可以除去沉淀物和污染的宿主细胞组分。在处理溶液的过程中，目的多肽保留在溶液中而宿主细胞污染物被沉淀。

一方面，本文报导了产生或者获得免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：

i)将由酸和水组成的溶液加入到已经被除去细胞和细胞碎片的细胞培养上清液中，用于调整pH值到pH4.5-pH5.5的值，其中溶液基本不含二价阳离子，

ii)将pH被调整的细胞培养上清液温育，并且

iii)从温育的细胞培养上清液中除去沉淀物从而产生或者获得免疫球蛋白，

其中所述细胞培养上清液包含不超过10mg/ml的浓度的免疫球蛋白，

其中加入的酸的浓度是5.5mol/l或者更低。

在一个实施方案中，在温育步骤中至少90%的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一个实施方案中，在温育步骤中至少95%的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一个实施方案中，在温育步骤中超过98%的免疫球蛋白保留在溶液中。

在一个实施方案中，产生多肽的方法包括以下步骤：

a)培养包含编码多肽的核酸的细胞，

b)从细胞培养上清液中除去细胞和细胞碎片，

c)调整细胞培养上清液的pH值到低于pH 5.5的值，

d)温育pH被调整的细胞培养上清液，并且

e)从经温育的细胞培养上清液中除去沉淀物，从而产生所述多肽。

另一个方面，本文报导了纯化细胞培养上清液的方法，其包括以下步骤：

a)将细胞培养上清液的pH值调整到低于pH 5.5的值，

b)温育pH被调整的细胞培养上清液，并且

c)从经温育的细胞培养上清液中除去沉淀物，从而纯化细胞培养上清液。

另一个方面是产生多肽的方法，其包括以下步骤：

i)提供包含编码多肽的核酸的哺乳动物细胞，

ii)在无血清的条件下培养所述细胞，

iii)回收细胞培养上清液，从细胞培养上清液任选地除去细胞或细胞碎片，和

iv)通过以下的步骤纯化细胞培养上清液，从而产生所述多肽：