[发明专利]莽草酸的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从西藏八角(Illicium griffitii)的果实（种子和果皮）中提取高纯度的(3R,4S,5R)-(-)-3,4,5-三羟基-1-环己烯羧酸(L-莽草酸)的方法。

本发明还涉及一种制备高纯度莽草酸的方法，所述莽草酸可用于生产禽流感药物达菲（奥塞米韦）。

更具体地，本发明涉及通过使用溶剂再结合使用醇（例如甲醇、乙醇或丙醇）的结晶技术从西藏八角(Illicium griffithii)的果实中分离天然左旋L-莽草酸，所述西藏八角产自印度东北部阿鲁纳恰尔邦(Arunachal Pradesh)，所述溶剂选自：己烷、石油醚、氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或两种或更多种溶剂的组合。任选地而不是必需地，有机酸例如乙酸也可用于重结晶目的。

技术背景

莽草酸可用作抗菌剂、抗真菌剂、除草剂的原料以及作为营养物质。最初，从日本大茴香（Japanese star anise）（植物名称-八角茴香(Illicium anise)八角茴香科）中分离痕量的莽草酸。后来，发现在许多植物中产生极痕量的莽草酸。然后，发现莽草酸是植物和微生物普通或莽草酸盐/酯途径中的中间代谢物。然而，发现世界上仅两种植物物种累积更多量的这种多羟基芳族酸，即大茴香（植物名称八角茴香，八角茴香科）和枫香树（植物名称-北美枫香(Liquidambar styraciflu)）的种子中。尽管有42种八角属的物种是天然可获得的，但仅有一种物种（即八角茴香）可用于制备莽草酸，且产率最大为7％w/w。

西藏八角(Hook.f.& Thoms.)属于八角茴香科，且是世界上最常见的八角属物种之一。在阿鲁纳恰尔邦，当地人将其称为‘Lissi’。其是一种小型到中型的树，生长于西卡门县(West Kameng)、达旺(Tawang)、洛西特县(Lohit)和下苏班西里县(Lower Subansiri)地区的亚热带和温带阔叶林，在西卡门县(West Kameng)地区的邦迪拉(Bomdila)分布广泛。西藏八角的果实在香料工业中使用。（参考文献：R.Duchok,K.Kent,A.Devi Khumbongmayum,A.Paul和M.L.Khan;阿鲁纳恰尔邦温带阔叶林的与干扰梯度有关的人口结构和药用树西藏八角的再生状态（Population structure and regeneration status of medicinal tree Illicium griffithii in relation to disturbance gradients in temperate broad-leaved forest of Arunachal Pradesh）；《现代科学》，第89卷,第4期,2005年8月25日,第673页)。

参考美国专利3,546,072，其中Araki等公开了可通过在培养基（发酵液）中培养产生5-脱氢莽草酸的棒状杆菌属的微生物来制备5-脱氢莽草酸，所述培养基包含碳源、氮源、无机材料和营养素。将制得的并累积的5-脱氢莽草酸从培养基中分离，过滤后通过调节pH并加入活性碳，以除去微生物细胞。所述活性炭吸收所述5-脱氢莽草酸，并用98％的乙醇洗脱。该洗脱物在减压条件下浓缩，然后产物从乙醇中沉淀出来。该参考文献没有暗示或揭示使用有机酸例如乙酸来促进高纯度莽草酸晶体从水性发酵液中沉淀出来。

参考美国专利4,769,061，其中Comai揭示了转基因植物，植物的基因组中包括了变异的草甘膦抗5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶的编码基因。该文献没有暗示如何从这种转基因植物的组织中分离莽草酸。

参考美国专利5,214,165，其中Sutherland等涉及了具有抗菌活性、抗真菌活性和除草活性的6-氟莽草酸衍生物。该文献没有暗示使用转基因微生物或使用草甘膦加入发酵过程以增加莽草酸的产出。该文献也没有暗示使用有机酸以辅助从发酵液中分离莽草酸。然而，该文献揭示了一类可用于该发明方法的PCCA。

参考美国专利5,605,818，其中Katsumata等揭示了一种通过使用培养在介质中的棒状杆菌属或短杆菌属的突变菌株来制备芳族氨基酸（例如色氨酸）的方法。这些突变菌株能够产生需要的芳族氨基酸，并且还具有比亲本菌株更高的转酮酶（transketolase）活性。所需的芳族氨基酸在培养过程中累积并由此回收。该文献没有暗示使用有机酸从肉汤中分离所需的PCCA。该文献揭示了多种可产生发酵液的微生物，所述发酵液可用于该发明。