[发明专利]降低细胞内蛋白质水平的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求基于35U.S.C.§119（e）的2010年1月15日提交的美国临时申请号61/295,636的优先权。

技术领域

本发明涉及降低细胞内蛋白质水平的方法。本发明尤其涉及通过同时下调蛋白质的合成（例如，通过降低mRNA的水平或减少mRNA的翻译）和增加蛋白质的降解来降低蛋白质水平的方法。

背景技术

某些细胞内蛋白的不适当激活与多种人类疾病的发生有关，这些疾病包括癌症、心血管疾病、免疫疾病和神经系统疾病。R.J.Mayer,Protein Degradation:The Ubiquitin-Proteasome System and Disease,Volume 4,Wiley-VCH,2007。例如，在很多癌症中，一种或多种癌基因的过表达在肿瘤的发生和发展过程中起到至关重要的作用。C.M.Croce,Oncogenes and Cancer,N.Engl.J.Med.2008;358:502-511。因此，使导致或促成疾病的靶蛋白有效下调的方法，将具有显著的诊断和治疗作用。另外，已使用了不同的工具用于降低靶蛋白的水平，以评估其生物学功能。

RNA干扰（RNAi）、基因敲除、核酶和反义寡核苷酸常用于不同的真核生物，以消除或降低细胞内蛋白质的水平。然而，在一些例子中，这些技术并不能有效地减少蛋白的表达。由于现有的基因产物仅以其自然的周转速率清除，靶蛋白的立即清除时常无法实现。需要考虑的另一个因素是靶蛋白的稳定性，它表示蛋白清除的速率和效率。即使完全破坏初期产生的mRNA，残留的长期存在的靶蛋白可能会混淆或掩盖对蛋白质清除表型的评价。

泛素依赖性蛋白水解是真核细胞用来降解细胞内蛋白质的一种主要的分解代谢途径。有3类酶协同催化蛋白泛素化：E1泛素活化酶、E2泛素偶合酶，以及E3泛素连接酶（见综述Hochstrasser(1996)Annu Rev.Genet30:40539）。E1和E2主要涉及泛素的活化和转移，泛素途径的底物特异性由E3泛素连接酶完成。最近，我们证实通过一种我们命名为蛋白质敲除（PKO）的技术，经改造的泛素连接酶可以被用来加速特定的细胞内蛋白质的水解。Zhou等Harnessing the ubiquitination machinery to target the degradation of specific cellular proteins.Mol.Cell.2000;6:751-6.Zhang等Exploring the functional complexity of cellular proteins by protein knockout.Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:14127-32.Zhang等Ectopic targeting of substrates to the ubiquitin pathway.Methods Enzymol 2005;399:823-33.Zhou P.Targeted protein degradation.Curr Opin Chem Biol 2005;9:51-5.

通过RNAi结合蛋白质敲除技术，申请人已进一步研究出迅速而有效地减少靶蛋白数量的方法。RNAi通过特定mRNA的降解或者对其翻译的抑制，在蛋白质的生物合成水平来控制蛋白质水平，而泛素连接酶介导的蛋白质敲除则在翻译后的水平加速目标蛋白的降解。这种组合方法一般适用于任何靶蛋白，包括不能被RNAi充分清除的蛋白质和具有相对长半衰期的蛋白质。

发明概述

本发明旨在提供一种降低细胞内至少一种靶蛋白水平的方法，所述方法包括使所述细胞接触第一试剂和第二试剂的步骤，其中所述第一试剂减少靶蛋白的合成，所述第二试剂增加靶蛋白的降解。第一试剂可以在第二试剂之前、之后或同时接触细胞。第一试剂和第二试剂可以在分开的递送载体中或在同一递送载体中。

第一试剂可以降低靶蛋白mRNA的水平或者减少靶蛋白mRNA的翻译。第一试剂可以是RNAi分子，例如小干扰RNA（siRNA），小发夹RNA（shRNA），以及小分子核糖核酸（miRNA）。第一试剂也可以是双链RNA（dsRNA），反义寡核苷酸或者核酶。