[发明专利]通过胰脏衍生的非内分泌上皮细胞和血管内皮细胞的组织复合物培养胰岛样组织的方法

权利要求书

1.一种通过培养产生胰岛素生成组织(IPT)的方法，所述方法包括：

制备非内分泌上皮细胞(NEEC)和血管内皮细胞(VEC)，其分离自或源自出生后的胰脏；

体外培养所述非内分泌上皮细胞(NEEC)；

体外培养所述血管内皮细胞(VEC)，所述血管内皮细胞(VEC)的培养至少部分地与所述非内分泌上皮细胞(NEEC)的培养分开进行；然后

体外产生组织复合物，所述组织复合物包含所述非内分泌上皮细胞(NEEC)和所述血管内皮细胞(VEC)。

2.权利要求1的方法，其中在所述制备中，所述非内分泌上皮细胞(NEEC)和所述血管内皮细胞(VEC)分离自胰脏丢弃物，所述胰脏丢弃物是从胰脏分离胰岛后余下的剩余组织；和/或

所述VEC来源于分离所述NEEC的相同供体组织或者来自待移植所述IPT的受体的组织。

3.权利要求1或2的方法，其中所述非内分泌上皮细胞(NEEC)的培养包括：

捕获所述非内分泌上皮细胞(NEEC)，其通过将所述胰脏丢弃物在含血清的培养基中接种于用胶原或其它细胞粘附物质包被的培养容器或培养基材上，随后进行培养，并且在所述捕获结束时或在所述捕获的过程中从培养物去除漂浮的组织碎片；

在所述捕获过程中的初始培养；和

初始集落生长，其通过在第二无血清培养基中培养直至具有10-30微米直径大小的NEEC克隆集落出现。

4.权利要求3的方法，其中所述第二无血清培养基包含人KGF(角质形成细胞生长因子)，或者包含所述人KGF以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充物或其它生长因子补充物。

5.权利要求3或4的方法，其还包括：

在所述捕获之后，在所述初始集落生长之前，通过用第一无血清培养基代替所述含血清的培养基，以及在所述第一无血清培养基中连续培养来诱导NEEC集落，所述第一无血清培养基包含FGF-2或其它成纤维细胞生长因子，或者包含成纤维细胞生长因子以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充物或其它生长因子补充物；和

在所述初始集落生长开始时用所述第二无血清培养基代替所述第一无血清培养基。

6.权利要求3-5中任一项的方法，其中所述NEEC的培养包括用于其选择性扩增的传代，包括：

在所述初始集落生长完成时或之后从所述培养容器或所述培养基材去除NEEC，然后从所述第二无血清培养基去除NEEC；通过用组织解离酶溶液处理从所述培养容器或所述培养基材去除NEEC；通过过滤和/或离心从所述第二无血清培养基去除NEEC；和

在所述去除后培养所述NEEC，其中：

将所述NEEC接种在用胶原或其它细胞粘附物质包被的培养容器或培养基材上；和

在第三无血清培养基中培养所述NEEC。

7.权利要求6的方法，其中用于在所述去除后培养所述NEEC的所述胶原或其它细胞粘附物质包含KGF或者KGF和抗Notch 1抗体，或者包含rock(Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶)抑制剂或者所述rock抑制剂和EGF(表皮生长因子)和HGF(肝细胞生长因子)以及BMP(骨形态发生蛋白)。

8.权利要求6或7的方法，其中所述第三无血清培养基补充了阿托伐他汀、辛伐他汀或其它他汀类。

9.权利要求6-8中任一项的方法，其还包括：

培养所述NEEC的去除后保留在培养容器或培养基材上的上皮细胞(剩余细胞(LOC))，其与去除的NEEC分开培养；和

在用所述剩余细胞(LOC)条件处理的培养基中或存在所述剩余细胞(LOC)的培养基中培养通过所述去除获得的NEEC。

10.权利要求6-9中任一项的方法，还包括：

在所述NEEC的去除后通过使用蛋白酶或其它解离酶来脱离保留在所述培养容器或所述培养基材上的上皮细胞(剩余细胞(LOC))；和

在用通过所述脱离获得的剩余细胞条件处理的培养基中或存在所述剩余细胞的培养基中培养通过所述去除获得的NEEC。