[发明专利]通过胰脏衍生的非内分泌上皮细胞和血管内皮细胞的组织复合物培养胰岛样组织的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于产生胰岛素生成组织(IPT)的培养方法，特别是通过培养分离自胰脏的胰脏衍生非内分泌上皮细胞(NEEC)和/或血管内皮细胞(VEC)，或者通过使用VEC增加天然胰岛细胞的增殖。本发明还涉及用于富集可以分化为胰岛素生成细胞的细胞的方法，包括在剩余细胞(LOC)的存在下培养NEEC的方法，所述剩余细胞分离自包含NEEC的胰脏细胞的原代培养物。

背景技术

已认识到胰岛移植是1型糖尿病的有效治疗，但是目前这种方法仅向少于20%的受体提供胰岛素不依赖性，并且需要来自超过一个供体的胰岛。即使对于已移植来自多个供体的胰岛的受体，最近的研究显示仅小部分的胰岛成功移入；更不用说供体组织可用性始终短缺。

弥补可移植的胰岛的短缺的一种策略是离体培养法，以便从可能位于供体胰脏中的胰岛先祖产生足量的功能性内分泌组织。虽然已提出许多方法，但是与天然胰岛产生的胰岛素相比，离体产生的胰岛样组织倾向于产生少量胰岛素，通常低于前者的1%，和/或缺少适当水平的葡萄糖反应性，即不能对增加浓度的葡萄糖应答而分泌更多胰岛素。

几个研究表明出生后的胰脏中胰岛先祖的存在以及通过施用外部胁迫体内再生内分泌细胞，例如，施用毒素如四氧嘧啶或链佐星，使胰脏进行例如胰切除的手术治疗，或者捆扎胰管(称为导管结扎)。最近，据发现导管结扎造成大量胰脏炎症和细胞凋亡然后胰岛祖细胞群体快速增殖(Xu etal.,2008,Cell 132:197-207)。虽然先祖在胰脏组织中的确切组织定位尚未阐明，但是许多研究已发现它们位于胰脏的导管或泡心(centroacinar)区域的证据，以及一些其它研究表明它们位于胰岛内。

尽管缺少先祖的确切特性，但是已测试各种方法以分离它们。一种这样的方法是流式细胞仪分选，其使用一组特定的细胞表面标记。这种方法的缺点是收集的细胞的量常不足以扩增培养，这部分是由于分选过程引起的损伤以及来自细胞表面标记的可能的偏差。另一方法是通过培养整个胰脏丢弃物来选择性扩增靶细胞。将胰脏丢弃物接种于具有适当的培养基和生长因子的培养容器中以促进预期的先祖而不是其它非靶细胞的增殖。采用这种方法的一个挑战是预测哪些细胞以及在哪个阶段细胞需要用给定培养方案选择性扩增。

弥补可移植的胰岛的短缺的另一策略是离体扩增天然胰岛细胞。据认为胰岛细胞如β细胞是终末分化的，因此难以促进它们在体外增殖，因此需要有效的方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，通过培养来制备胰岛素生成组织(IPT)的方法包括：体外产生由均分离自或源自出生后的胰脏的非内分泌上皮细胞(NEEC)和血管内皮细胞(VEC)组成的组织复合物。

根据本发明的第二方面的产生胰岛素生成组织(IPT)的方法包括：制备血管内皮细胞(VEC)和天然胰岛细胞，其分离自或源自出生后的胰脏；以形成单层的方式体外培养血管内皮细胞(VEC)；以及在所述单层上接种并生长天然胰岛细胞。

根据本发明的第三方面的制备胰岛素生成组织(IPT)的方法包括：制备非内分泌上皮细胞(NEEC)，其分离自或源自出生后的胰脏；以粘附在培养容器的表面上或培养基材(“培养基材(culture substrate)”此后用来包括任何形式的支架)上的状态体外培养非内分泌上皮细胞(NEEC)；通过用组织解离酶处理来从培养容器或培养基材去除非内分泌上皮细胞(NEEC)以剩下仍然粘附在培养容器或培养基材上的剩余细胞(LOC)；互相分离地培养去除的非内分泌上皮细胞(NEEC)和剩余细胞(LOC)；以及在通过单独培养的剩余细胞(LOC)条件处理的培养基中或者在单独培养的剩余细胞(LOC)的存在下培养非内分泌上皮细胞(NEEC)以形成细胞簇。

附图说明

[图1-A]图1A-1D为显微图像，示出NEEC生长的转变过程；图1A示出在细胞捕获步骤中保持粘附在胶原I包被的平皿表面上的细胞(实施例2)；

[图1-B]图1B示出在包含20ng/ml FGF-2和1400U/ml LIF的无血清培养基中诱导生长的细胞集落(实施例3)；

[图1-C]图1C示出在包含10mM烟酰胺、0.02微摩尔(10^-6M)2-巯基乙醇和10ng/ml的KGF的无血清培养基中进一步生长2天的细胞集落(实施例4)；

[图1-D]图1D示出在相同的无血清培养基中培养7天后大部分为上皮细胞的密集单层的形成(实施例4)；