[发明专利]改进的大范围核酸酶重组系统

权利要求书

1.一组遗传构建体，其包含：

a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子所编码：

(N)_n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)_m(i)

其中，n和m为整数并且代表0或1，前提是当n＝1时m＝0而当n＝0时m＝1；因此组分N可被设置在HOMO1之前或HOMO2之后，并且组分P和M可按顺序P-M或M-P设置；

其中N包含组分(PROM1)-(NEG)-(TERM1)；P包含组分(PROM2)-(POS)-(TERM2)；并且M包含组分(PROM3)-(MCS)-(TERM3)；以及

其中PROM1为第一转录启动序列；NEG为阴性选择标记；TERM1为第一转录终止序列；HOMO1为与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分同源的部分；PROM2为第二转录启动序列；POS为阳性选择标记；TERM2为第二转录终止序列；PROM3为第三转录启动序列；MCS为多克隆位点；TERM3为第三转录终止序列；HOMO2为与所述核酸酶DNA靶序列之后的基因组部分同源的部分；

b)至少一种选自包括构建体(ii)或(iii)在内的组的构建体，所述构建体(ii)或(iii)由至少包含以下组分的核酸分子所编码：

PROM4-NUC1(ii)；

NUC2(iii)；或

所述组还包含序列(iv)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质：

NUC3(iv)；

其中PROM4为第四转录启动序列；NUC1为大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF)；MEGA2为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式；MEGA3为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述核酸酶DNA靶序列；并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)被设置成与构建体(i)共转染到至少一种靶细胞中。

2.权利要求1的构建体组，其中来自构建体(i)的所述组分HOMO1和HOMO2包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少200bp并且不多于6000bp的序列。

3.权利要求1或2的构建体组，其中来自构建体(i)的所述组分HOMO1和HOMO2包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少1000bp并且不多于2000bp的序列。

4.权利要求1、2或3的构建体组，其中所述组分(POS)选自：新霉素磷酸转移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3)、潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph(SEQ ID NO 4)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因pac(SEQ ID NO5)、杀稻瘟素S脱氨酶抗性基因bsr(SEQ ID NO 6)、博来霉素抗性基因sh ble(SEQ ID NO 7)。

5.权利要求1至4中任一项的构建体组，其中所述组分(NEG)选自：缺失CpG岛的单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQID NO 8)、与缺失CpG岛的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因偶联的胞嘧啶脱氨酶CD：UPRT DelCpG(SEQ ID NO 9)。

6.权利要求1至5中任一项的构建体组，其中所述元件PROM1、PROM2、PROM3和PROM4选自：巨细胞病毒的立即早期启动子pCMV(SEQ ID NO 10)；猿病毒40启动子pSV40(SEQ ID NO 11)；人延伸因子1α启动子phEF1α(SEQ ID NO 12)；人磷酸甘油酸激酶启动子phPGK(SEQ ID NO 13)；小鼠磷酸甘油酸激酶启动子pmPGK(SEQ ID NO 14)；人多聚泛素启动子phUbc(SEQ ID NO 15)；来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子pHSV-TK(SEQ ID NO 16)；人生长抑制特异性5启动子phGAS5(SEQ ID NO 17)；四环素响应元件pTRE(SEQ ID NO18)；来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19)；来自口蹄疫病毒的IRES序列IRES FMDV(SEQ IDNO 20)，SV40。