[发明专利]改进的大范围核酸酶重组系统无效

专利信息
申请号: 201180014623.9 申请日: 2011-02-18
公开(公告)号: CN102858966A 公开(公告)日: 2013-01-02
发明(设计)人: 克里斯托夫·德朗达;让-皮埃尔·卡巴尼奥尔斯 申请(专利权)人: 赛莱克蒂斯公司
主分类号: C12N9/22 分类号: C12N9/22;C12N15/90
代理公司: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 彭鲲鹏;卢蓓
地址: 法国*** 国省代码: 法国;FR
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摘要:
搜索关键词: 改进 范围 核酸酶 重组 系统
【说明书】:

发明涉及一组试剂,其允许将DNA序列引入靶细胞基因组中的特定位点。特别地,该DNA序列编码基因,并通过诱导型同源重组(homologous recombination,HR)事件被引入靶细胞中。本发明还涉及一组遗传构建体,其包含与大范围核酸酶基因组靶位点侧翼的部分具有同源性的至少两个部分和阳性选择标记及阴性选择标记;以及涉及将DNA序列引入靶细胞基因组的改进方法。

自超过25年前酵母中的首个基因靶向实验(Hinnen等,1978;Rothstein,1983)以来,已在多种细胞中采用同源重组(HR)来插入、替换和缺失基因组序列(Thomas和Capecchi,1987;Capecchi,2001;Smithies,2001)。哺乳动物细胞中靶向事件的发生频率非常低,使得对天然HR的利用变得不切实际。可以通过基因座处的特定DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)来显著提高同源重组的频率(Rouet 等,1994;Choulika等,1995)。该DSB可以由大范围核酸酶(meganuclease)诱导,所述大范围核酸酶是识别大DNA识别靶位点(12至30bp)的序列特异性内切核酸酶。

大范围核酸酶对其DNA靶标表现出高特异性,这些蛋白质可切割独特的染色体序列,因此不影响全基因组完整性。天然大范围核酸酶主要以归巢内切核酸酶(homing endonuclease)为代表,所述归巢内切核酸酶是见于真核细胞、细菌和古细菌(archae)中的一类广泛分布的蛋白质(Chevalier和Stoddard,2001)。对I-Scel和HO归巢内切核酸酶的早期研究已阐明了可如何将这些蛋白质的切割活性用于启动活细胞中的HR事件,并且已证明了染色体DSB致重组特性(recombinogenic property)(Dujon等,1986;Haber,1995)。从那时起,大范围核酸酶诱导的同源重组已成功地在细菌(Posfai等,1999)、哺乳动物细胞(Sargent等,1997;Donoho等,1998;Cohen-Tannoudji等,1998)、小鼠(Gouble等,2006)和植物(Puchta等,1996;Siebert和Puchta,2002)中用于基因组工程目的。

最近,已改造TAL效应子内切核酸酶(TAL effector endonuclease,TALEN)以高特异性地识别和切割DNA靶标。这些TALEN包含与核酸酶结构域(例如,FokI)融合的TAL(转录激活因子样)效应子DNA结构域(Christian等,2010)。

另一类核酸酶也可用于切割基因组靶并因此诱导DSB,该另一类核酸酶被称为锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN),并且是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人造限制酶。可以以与TAL类似的方式改造锌指结构域以靶向任意DNA序列(Kim等,1996)。

虽然可获得可在靶细胞基因组中特定位点处诱导DSB的材料在增加,但是还未开发出常规可重复地转化靶细胞群的方法和材料。所存在的多种原因包括原核生物基因组或更特别是真核生物基因组固有的复杂性。工作人员越来越多地发现基因组具有卓越的抗损伤能力,这恰是DSB的本质所在。此外,在产生转化方法中,对所有转化方法而言都存在的技术限制(即从背景未转化细胞群中常规地鉴别出稀少转化体的能力)继续表现出问题。

提供了利用HR在将目的序列引入靶细胞或生物体的基因组中任意位点的潜能的方法,从而允许可能比以往任何时候更细致地进行基因组操作。

本发明的发明人现在已开发出一组新的遗传构建体,其包含:

a)由核酸分子编码的构建体(i),其至少包含以下组分:

(N)n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)m(i)

其中,n和m是整数并且代表0或1,前提是n=1时,m=0而当n=0时,m=1;因此组分N可设置在HOMO1之前或NOMO2之后,并且,组分P和M在HOMO1与HOMO2之间的顺序可设置为P-M或M-P;

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