[发明专利]使多能性哺乳细胞分化的培养方法

权利要求书

1.使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其中，

使用在培养表面具有多个微容器的细胞培养容器培养多能性哺乳细胞，得到至少部分地分化为内胚叶系列的细胞的细胞群体，在所述细胞培养容器中具有由所述微容器的空间结构的高度为10μm～500μm、底部面积为100μm²～1mm²的空间构成的培养表面。

2.如权利要求1所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述多能性哺乳细胞选自胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、畸形癌细胞/精原干细胞的任一种。

3.如权利要求1或2所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

在一个所述微容器中播种1个～3×10⁵个所述多能性哺乳细胞，得到所述细胞群体。

4.如权利要求1～3中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

利用包含选自TGF-β家族、FGF家族和PI3-激酶言号传导通路抑制剂中的一种物质或两种以上的混合物的培养基培养所述多能性哺乳细胞，得到所述细胞群体。

5.如权利要求4所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述TGF-β家族的成员为选自Nodal、活化素A、活化素B、TGF-β、BMP2和BMP4中的一种物质或两种以上的混合物。

6.如权利要求4或5所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述FGF家族的成员为选自b-FGF、FGF-4、FGF-2中的一种物质或两种以上的混合物。

7.如权利要求4～6中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述PI3-激酶信号传导通路抑制剂为选自LY294002、雷帕酶素、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂Ⅰ、Akt抑制剂Ⅱ、Akt抑制剂Ⅲ、NL-71-101中的一种物质或两种以上的混合物。

8.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

得到至少部分表达SOX17、未表达AFP的细胞群体。

9.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

得到至少部分表达SOX17、未表达Pdx-1的细胞群体。

10.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

得到至少部分表达FoxA1或FoxA2、未表达AFP的细胞群体。

11.如权利要求1～7中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

得到至少部分表达FoxA1或FoxA2、未表达Pdx-1的细胞群体。

12.使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

利用包含选自FGF、BMP2、HGF、KGF、EGF、TGF-α、HB-EGF、VEGF、PDGF、DMSO、地塞米松、制瘤素M和胰岛素中的一种或两种以上的物质的培养基培养权利要求1～11中任一项所述的分化为内胚叶系列的细胞的细胞群体，得到至少部分地存在表达白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)的任一种的细胞的第二细胞群体。

13.如权利要求1～12中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

在氧浓度为4％以下的大气中培养。

14.如权利要求1～13中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述细胞培养容器为包含丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙二醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸/苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯/乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂和硅树脂中的一种或其以上的组合的树脂成型品。

15.如权利要求1～14中任一项所述的使多能性哺乳细胞分化的培养方法，其特征在于，

所述微容器在沿所述微容器的空间结构的高度方向形成的侧壁的上部50％以上的部分，所述底部和该侧壁的各侧面形成的角度为80°～90°。