[发明专利]使多能性哺乳细胞分化的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及多能性细胞的培养，特别是涉及使多能性哺乳细胞分化的培养方法。

背景技术

在对从组织分离的细胞进行试验、检查中使用的方法在生物技术相关领域为不可缺少的方法。广泛用于疾病、病态的诊断、新药的探索及药效的判定或动物检查、植物检查、环境污染物质的试验等。因此，在生物技术领域使用的细胞类极为多样。

近年来，胚胎干细胞(Embryonic stem cells：ES细胞)、诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells：iPS细胞)等多能性细胞的研究得以发展。多能性细胞是可分化为构成形成生态的组织/器官/脏器的全部细胞种类的防沙。ES细胞成为用于研究多能性细胞的生物学性质及在初期胚内的分化基础的机制的强有力的模型体系，提供哺乳动物的遗传性操作以及作为结果产生的用于商业、医学及农业学应用的机会。进一步地，开发了使用ES细胞的适当的增殖及分化，进行疾病、病态的诊断、新药探索及药效判定的方法。

分离的多能性细胞还具有直接用于试验的情况，但大多数情况下进行使细胞在培养皿、试验管中增殖及分化的操作。使用该培养细胞进行各种检查。已分离的多能性细胞要求显示与在分化了的生物体内的试验、所谓in vivo试验一样的药物感受性、毒性反应，同时要求高效地分化为目的细胞。

然而，现状是多能性细胞的多能性及调节分化的生化学机制几乎未被理解。例如，作为由多能性细胞分化的方法，专利文献1中公开有用于产出分化了的哺乳动物细胞的组合物及方法。详细地说，公开有在细胞培养中采用在饲养层上或无饲养的条件下培养细胞，以及为了生成由多能性哺乳动物干细胞分化了的哺乳动物细胞，使这些细胞进而与PI3-激酶通路抑制剂及TGFb家族的成员接触的细胞分化方法。

不仅上述方法，而且在非专利文献1中也公开有根据胚叶体(Embryoid Body)的凝集体的大小，多能性细胞的分化效率变化。这样，为了得到均一的内胚叶系列的细胞或由该细胞分化的例如肝细胞、β细胞，控制该凝集体的大小是非常重要的一个要素。在非专利文献1记载的方法中，将具有细胞粘着性的基质胶以直径数十μm～数百μm的大小在培养底面以一定间隔配置，形成细胞粘着区域。在细胞粘着区域的周围通过涂敷细胞非粘着性聚合物，使细胞选择性地与该细胞粘着区域粘着，控制胚叶体的凝集体的大小。

专利文献1：日本特表2008-509676号公报

非专利文献1：Celine Liu Bauwens，Raheem Peerani，SylVia Niebruegge，kimberly a.Woodhouse，Eugenia KumacheVa，Mansoor Husain，Peter W.Zandstra著、″Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories″，STEM CELLS 2008；26，pp2300-2310。

发明内容

但是，在非专利文献公开的培养方法中具有操作复杂、成本高的问题。另外，培养期间中还具有一部分细胞与细胞非粘着部分相粘着的情况，在高效率地使细胞分化方面具有问题。这将难以控制胚叶体的凝集块的尺寸。

因此，本发明目的在于，提供使用表面具有多个微容器的细胞培养容器，实现胚叶体尺寸的控制，能够以控制胚叶体尺寸的状态进行分化诱导的方法，在所述细胞培养容器中，具有由该微容器的底部面积为100μm²～1mm²，深度为10～500μm的空间构成的培养表面。

使本发明的多能性哺乳细胞分化的培养方法的一种方式是使用培养表面具有多个微容器的细胞培养容器。细胞培养容器具有由微容器的空间结构的高度为10μm～500μm、底部面积为100μm²～1mm²的空间构成的培养表面。使多能性哺乳细胞分化的培养方法使用了该细胞培养容器，培养多能性哺乳细胞，得到至少部分地分化为内胚叶系列细胞的细胞群体。使用该微容器，控制培养的胚叶体尺寸。而且，使用控制了胚叶体尺寸的状态，诱导细胞的分化。由此，改善使多能性哺乳细胞分化的效率。