[发明专利]用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的密切相关的血清型的测定法

说明书

交叉参考相关申请

本申请要求2010年2月16日提交的美国临时专利申请No.61/304,941的提交日的权益，所述临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包含已通过EFS-Web提交并且通过引用整体并入本文的序列表。于2011年1月31日创建的所述ASCII拷贝被命名为，用于检测HPV的相关血清型的序列表，其大小为7.55千字节。

发明背景

已鉴定了超过80个类型的人乳头瘤病毒(HPV)。不同类型的HPV引起了从良性增生性疣至恶性癌症的广泛多样的生物学表型(关于综述，参见McMurray等人,Int.J.Exp,Pathol.82(1):15-33(2001))。HPV6和HPV11是最常见的与良性疣相关的类型，然而HPV16和HPV18是与恶性病损最频繁相关的高风险类型。因此，临床样品中HPV的具体类型的确定对于预测发生HPV相关疾病的风险是至关重要的。

几种基于核酸的方法已被用于鉴定和定量临床样品中的特定HPV类型，例如通过原位杂交、Southern印迹分析、杂交捕获或聚合酶链式反应(PCR)来检测病毒核酸。HybridII(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)测定法使用抗体捕获和非放射性信号检测，但仅检测给定组的HPV类型中的单个靶(参见，例如，Clavel等人,British J.Cancer 80(9):1306-11(1999))。此外，由于HybridII测定使用RNA探针的混合物(针对高风险或低风险HPV类型的探针混合物是可获得的)，其不提供关于样品中检测到的具体HPV类型的信息，而仅指示高风险或低风险HPV的存在的阳性或阴性。类似地，许多基于PCR的方法通常包括扩增单个特定HPV靶序列，随后将所得的扩增子印迹至膜上，然后用放射性标记的寡核苷酸探针进行探测。

其它方法通过使用商购可得的、能够PCR扩增存在于样品中的多个HPV类型的共有引物来利用不同类型的特定HPV基因之间的高同源性。随后使用类型特异性寡核苷酸探针来鉴定特定HPV类型的存在。参见，例如，Kleter等人,Journal of Clinical Microbiology 37(8):2508-2517(1999);Gravitt等人,Journal of Clinical Microbiology38(1):357-361(2000)。类似地，利用简并PCR引物的测定法利用了HPV类型之间的同源性，从而允许检测更多的HPV类型(与利用特定引物组的方法相比较)。参见，例如，Harwood等人,Journal of Clinical Microbiology 37(11):3545-3555(1999)。此类测定还需要另外的实验来鉴定具体的HPV类型。

上述PCR法可与几个问题相关。例如，HPV类型之间反应效率的差异可导致一些类型相对于其它类型的不成比例的扩增。此外，扩增的平衡被驱向以更高的拷贝数存在于样品中的那些类型，所述类型将消耗PCR反应组分，从而使得更不可能扩增含量较少的HPV类型。

本领域中还描述了基于5'外切核酸酶荧光PCR测定(Taq-Man PCR)，其允许实时检测PCR产物和消除对放射性的需要。参见，例如，美国专利No.5,538,848;Holland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280(1991)。该方法利用标记的探针，其包含荧光报告分子(荧光团)和与PCR引物之间的靶DNA杂交的猝灭剂。荧光团的激发导致荧光团释放荧光信号，该荧光信号可被猝灭剂猝灭。可利用TAQ DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性检测扩增子，该酶在PCR引物的延伸过程中降解遇到的双链DNA，从而从探针释放荧光团。此后，荧光信号不再被猝灭，并且可利用自动化荧光计实时检测荧光信号的积累(其与靶DNA的量直接相关)。

Taq-Man PCR测定法已被改造用于检测HPV类型。Swan等人(Journal of Clinical Microbiology 35(4):886-891(1997))公开了，利用扩增L1基因的一部分的类型特异性HPV引物和类型特异性探针的荧光探针测定法。Swan等人的测定法在固定数目的PCR循环结束时测量(终点读取)，而非实时测量，荧光信号。