[发明专利]移除免疫球蛋白聚集物

说明书

本文报道了通过选择性吸附至未衍生化的孔度受控的玻璃，从单体免疫球蛋白中分离二聚体和寡聚体免疫球蛋白的方法。

发明背景

蛋白质，尤其是免疫球蛋白在目前的医学产业中发挥重要的作用。在制药应用中使用的多肽主要是在哺乳动物细胞中生产的，例如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.细胞等。

由于其化学和物理的特性，例如分子量和包括二级修饰的结构域构造，免疫球蛋白的下游加工是非常复杂的。例如，不仅对于配制的药物，而且也对于下游加工(DSP)中的中间产物，浓缩的溶液是实现经济化处理和应用储藏的小体积所必需的。生物技术生产的免疫球蛋白的下游加工一般包括三个层析步骤：使用例如蛋白A的第一亲和层析步骤，以移除非免疫球蛋白分子，随后通常为2个离子交换层析步骤，最后一个步骤是移除DNA和HCP污染物的所谓的抛光步骤。纯化的免疫球蛋白是在低浓度溶液中获得的，在将抗体配制为药物制剂之前需要浓缩步骤。由于在下游加工过程中所需要的非天然的条件，通常单体的免疫球蛋白倾向于形成二聚体、寡聚体和更高阶的聚合物。这些聚合物不具有预期的单体免疫球蛋白的抗原结合活性并且需要被移除。

Ghose，S.等人(Biotechnol.Bioeng.87(2004)413-423)报道了在未衍生化的硅石上制备蛋白质纯化。Reifsnyder，D.H.等人(J.Chrom.A 753(1996)73-80)报道了使用乙醇和NaCl的组合，从粗制的发酵肉汤和特定洗脱液中捕获IGF-I。Lifsics，M.R.和Williams，R.C.Jr(Biochem.23(1984)2866-2875)报道了在8M尿素中在孔度受控的玻璃上进行分子筛层析，用于从牛神经纤维中分离蛋白质的单体和聚集的形式。Ghose，S.等人(Abstracts of Papers，224th ACS National Meeting，Boston，MA，United States，August 18-22，2002(2002)，BIOT-317Publisher：American Chemical Society，Washington，D.C.)报道了未衍生化的裸露硅胶作为制备的静态相用于蛋白质的加工纯化的用途。

在US 4,606,825中，报道了使用具有非交联的共价结合的聚乙烯亚胺功能的孔度受控的玻璃来分离和回收免疫球蛋白G的方法。US2002/0010319中报道了使用离子交换层析树脂和梯度洗脱，从包含二聚体和/或多聚体的混合物中分离多肽单体的方法。Mizutani，T.和Mizutani，A.，J.Chrom.168(1979)143-150报道了在孔度受控的玻璃和羧甲基纤维素上层析的蛋白质的洗脱模式的比较。DE 39 07 162 A1中报道了使用具有羧甲基化的孔度受控的玻璃层析对髓过氧化物酶的分离和纯化。

发明概述

已发现在未衍生化的孔度受控的玻璃(uCPG)表面选择性结合存在于pH值为从pH 5至pH 7.5的溶液中的二聚体和寡聚体(即，聚集的)G类免疫球蛋白(IgG)。通过应用每克总IgG从50m²至150m²uCPG表面，多至95％的可溶性聚集物结合于颗粒(由SE-HPLC确定)。同时，仅约10％至20％的单体吸附到表面上。这可以通过向包含单体和聚集物的溶液中分批添加uCPG并其后通过离心或过滤移除具有结合的聚集物的uCPG，来容易地实现。蛋白质与uCPG经过6天孵育不导致形成聚集物。此外，在与uCPG孵育后，没有观察到蛋白质二级或三级结构的可检测的改变。

因此，本文报道的一个方面是用于获得单体形式或聚集形式的多肽的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液，

b)在从pH4至pH6的pH值下，孵育溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃，和

c)从孵育的溶液中回收多肽并从而获得单体形式的多肽，

或下列步骤

a)提供包含单体形式和聚集形式的多肽的溶液，

b)在从pH4至pH6的pH值下，孵育所述溶液与未衍生化的孔度受控的玻璃，

c)从溶液中移除孔度受控的玻璃，

d)用pH值为从pH 2至pH 3，或从pH 7至pH 8的溶液孵育移除的孔度受控的玻璃，从而获得聚集形式的多肽。

本文报道的另一个方面是生产多肽的方法，包括

a)提供包含编码多肽的核酸的真核细胞，

b)培养细胞，以表达多肽，