[发明专利]排除假阴性的PCR 检测方法和其中使用的引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于PCR法的微生物检测方法。特别是，本发明涉及一种微生物检测方法，其采用针对作为检测对象的微生物中的特异基因而设计的引物进行PCR反应并根据PCR产物的有无定性地判定微生物是否存在。

背景技术

就啤酒制品等样品而言，进行微生物检测在担保品质方面是非常重要的。作为样品中可能存在的微生物的检测方法，已知有几种方法。采用PCR进行判定为样品中的有害微生物的检测法之一，其作为简便、迅速而且准确的方法广泛应用于啤酒、其他食品等样品中的微生物检测中。利用了PCR的检测方法中，为了提高检测的灵敏度和特异性，研究了例如浓缩样品、使用特异性高的探针或者引物、组合多个探针或者引物、提高基因提取的效率等。具体而言，已知有：通过在引起食物中毒的菌种的菌种鉴定方法中组合使用多个特异的探针来回避假阳性和假阴性的方法（文献1）；在军团菌属的检测方法中通过在浓缩样品以及基因的提取方法方面下功夫而提高靶基因的提取效率、回避假阴性的方法（文献2）；在S.pastrianus的基于LAMP法的检测方法中，通过使用近亲菌种中没有的特异性高的引物提高检测灵敏度以及精度的方法（文献3）等。

发明内容

通过PCR进行微生物检测时，为了确认从微生物试样中确实提取出基因组DNA，有时对管家基因（例如细菌的16S rDNA、酵母的26S rDNA）也进行PCR反应。由于管家基因与通常的基因相比拷贝数多，用提取自同一试样的基因组DNA进行靶基因以及管家基因的PCR时，如果从菌体提取的DNA浓度低，有时只有管家基因能被检测出。结果，即便制品等中混入了有害微生物也会判定为阴性，致使品质管理方面产生问题。因此，必须构建该微生物混入制品等时不进行假阴性判定而采用PCR法就能准确检测的PCR检测系统。因此，期望的是将应该检测出的对象基因的检测灵敏度和用于确认从菌体中的DNA提取的管家基因的检测灵敏度设为同等。

本发明是一种微生物检测方法，所述微生物检测方法包括：应用用于扩增样品中可能存在的应该检测出的微生物的靶基因序列的第1引物对以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对进行PCR反应，在上述阳性对照基因序列被扩增而上述靶基因序列不被扩增时判定为上述微生物不存在，在上述阳性对照基因序列被扩增而且上述靶基因序列也被扩增时判定为上述微生物存在；其中，上述PCR反应中的上述靶基因的检测灵敏度和上述阳性对照基因的检测灵敏度是同等的。

更具体而言，本发明为上述方法，其中，第1引物对中的至少1个引物中相对于靶基因序列的互补序列存在变异、和/或第2引物对中的至少1个引物中相对于阳性对照基因序列的互补序列存在变异；优选存在核苷酸向引物的插入。

特别是，本发明为上述方法，其中，样品中可能存在的应该检测出的微生物为糖化酵母，靶基因为STA1，阳性对照基因为酵母的26S rDNA。

更具体而言，本发明为上述发明，其中，第1引物对为如下的一对引物：包含序列号1的序列的引物以及包含序列号3的序列的引物；和/或第2引物对为如下的一对引物：包含序列号4的序列的引物以及包含序列号5的序列的引物。

另外，本发明为一种引物组，所述引物组包含用于扩增样品中可能存在的微生物的靶基因序列的第1引物对、以及用于扩增上述样品中的阳性对照基因序列的第2引物对；同一PCR反应条件下上述靶基因的检测灵敏度和上述阳性对照基因的检测灵敏度是同等的。

更具体而言，本发明为上述上述引物组，其中，上述第1引物对中的至少1个引物中相对于靶基因序列的互补序列存在变异；和/或第2引物对中的至少1个引物中相对于阳性对照基因序列的互补序列存在变异，优选存在核苷酸向引物的插入。

特别是，本发明也为上述发明，其中，第1引物对为如下的一对引物：包含序列号1的序列的引物以及包含序列号3的序列的引物；和/或第2引物对为如下的一对引物：包含序列号4的序列的引物以及包含序列号5的序列的引物。

附图说明

图1表示糖化酵母（S.diastaticus）（A）和酿酒酵母（S.cerevisiae）（B）中的葡糖淀粉酶基因(STA1)的构造差异，以及对应STA1基因扩增用引物（F4和R6）的区域。另外，图1中表示，糖化酵母的STA1具有酿酒酵母的S2、S1和SGA的一部分融合而成的构造。F4、F6分别表示实施例1中使用的引物STA1-F4、STA1-R6的位置。