[发明专利]生物标记物成像期间增加可检测光子数目的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的使来自生物标记物的光信号红移的方法。尤其本发明涉及发光的生物标记物和荧光团之间的激发机制。本专利申请还涉及用于实施根据本发明方法的试剂盒以及未结合的荧光团产生光子的用途，与生物标记物产生的光子相比，未结合的荧光团产生光子为红移的。

背景技术

产生光信号的生物标记物的用途已经改革了生命科学的多个方面，特别是其允许实时观察体内如内吞作用、胚胎发育、感染、肿瘤发展和钙信号的现象。越来越多地，此类相同的技术还被用于使更多的生物和药学过程在靶细胞、分离的组织或整个生物体中原位可视化。

实质上有三个用于使用生物标记物产生基于光信号的光发射的机制：

1、生物发光。

2、化学发光。

3、荧光。

生物发光是由活生物体或其片段如酶产生和发射光。生物发光是化学发光（见下文）的天然发生的形式，其中能量通过化学反应以光发射的形式释放。在大多数生物发光反应中涉及三磷酸腺苷（ATP），因而通常生物发光反应发生在体内。

化学发光是化学反应产生的光的发射。其不同于生物发光，因为化学反应的成分没有必要发生在体内。

荧光是由吸收不同波长辐射的物质的光发射。在大多数情况下，某一波长的光的吸收诱导具有更长波长的光的发射。荧光分子通常称为荧光团，在激发后光的发射中不涉及化学反应。

以生物发光为例，已经用编码生物发光探针（如水母发光蛋白（aequorin）或各种荧光素酶）的基因进行遗传修饰的生物体的使用，允许在活生物体或小动物模型中使得许多生物过程非侵入地可视化（1-3）。生物发光成像是高度敏感的，理由在于由于哺乳动物组织的非常低水平的内在生物发光，在完整生物体如小鼠中，信号可被视觉检测（4）。生物发光探针，如水母发光蛋白（5、6）或酶荧光素酶（细菌、萤火虫、海萤（Cypridina）（7）或海肾（Renilla）（8））已被整合到宿主细胞或病原体中用于生物发光成像。这些工具已被应用于范围从感染和肿瘤发展到钙信号的研究。然而，这些生物标记物的大多数在色谱的蓝—绿—黄（400-650nm）区域内发射光（9），其与哺乳动物组织的主要吸收谱重叠，特别地与氧合血红蛋白、脱氧合血红蛋白和黑色素的吸收谱重叠，从而降低了检测效力（1、10）。由于这些吸收物的存在，体内光学成像中的主要挑战是通过开发近红外（NIR）红谱（650-900nm）发射光的光学探针，实现更高水平的灵敏度，在活哺乳动物组织中，该光仅被微弱吸收。

即使有这些缺点，该技术的使用其自身已便于应用于涉及比如麻醉的和非麻醉/清醒的小啮齿动物的实验中（21）。如上所述，在小啮齿动物模型中（以及更通常地在哺乳动物中），容易在色谱的蓝—黄区域中被吸收的各种血红蛋白和组织的存在降低了激发和检测荧光团的能力，或者如果其在相同谱中，降低了监测由修饰的细胞和细菌产生的发光信号的能力。

改善来自生物发光源的可检测光子的数目的显著努力导致开发了大量新的和/或改善的生物发光探针以及增加在色谱红区域（>650nm）发射光子的数目的技术。没有证实由于太难而不能够设计在近红外（NIR）-红区即能激发又能发射的荧光团或荧光蛋白（22）。

但是，已经证实，为了实现生物发光发射的相似红移更加困难。一种建立所需红移的方法已经开发能够在光谱NIR红区部分的这一部分发射的荧光素酶变体。但是，目前为止开发的大多数突变体/突变已经导致在黄—绿区域发射（9），并且仅有几个成功的红色生物发光产物的实例（11），而且这样的NIR红区工程化的蛋白质通常产生比非工程化黄—绿版本显著更低的信号。

考虑到产生NIR红区生物发光的困难，因而显著的努力已经朝向了创造可用的方法以使用生物发光共振能量转移（BRET）在发射的光子中产生红移（13）。一些小组已经证实利用结合至QDs的荧光素酶（8）或其它具有大的斯托克斯位移的荧光团（7）的技术是成功的。

在这些以前的方法中，研究者调查了通过使海肾线虫（Renilla reniformis）的八突变变体缀合至量子点的BRET，其中海肾线虫作为能量供体，量子点（QDs）作为能量受体，从而实现能量转移后来自QD的在655nm处的发射峰值（8）。更最近地，将生物素化的海萤荧光素酶缀合至远红荧光靛青衍生物，在675nm提供了发射峰（7）。但是，在BRET中，供体和受体必需极为贴近（10nm以下（12-15）），因为其涉及从发光供体至受体的非辐射能量转移。