[发明专利]稳定的功能嵌合纤维二糖水解酶I类酶

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据美国法典第35卷第119条要求于2010年6月1日提交的美国临时申请序列号61/350,412的优先权，该美国临时申请的公开内容在此通过引用方式并入。

关于联邦资助研究的声明

本发明在由美国陆军研究处(Army Research Office)授予的基金第W911NF-09-D-0001号下的政府资助下作出。政府具有本发明中的某些权益。

技术领域

本公开内容涉及生物分子工程和设计，以及工程化的蛋白和核酸。

背景

纤维素酶混合物在生物质转化过程中的表现除了取决于纤维素底物的物理状态和组成以外，还取决于许多酶特性，包括稳定性、产物抑制、不同纤维素酶组分之间的协作、生产性结合(productive binding)相对非生产性吸附(nonproductive adsorption)、以及pH依赖性。鉴于纤维素水解的多变量性质，具有多样的纤维素酶选择来优化用于不同应用和原料的酶制剂是令人期望的。

概述

本公开内容提供了大体纯化的嵌合多肽，其包括来自至少两个不同的亲本纤维二糖水解酶I(CBH I)多肽的至少两个结构域，其中这些结构域从N端到C端包含：(区段1)-(区段2)-(区段3)-(区段4)-(区段5)-(区段6)-(区段7)-(区段8)；其中：区段1包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基从大约1或从大约18或19到大约x₁至少50-100％相同的序列；区段2包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基x₁到大约x₂至少50-100％相同的序列；区段3包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基x₂到大约x₃至少50-100％相同的序列；区段4包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ IDNO：10(“5”)的氨基酸残基x₃到大约x₄至少50-100％相同的序列；区段5包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基x₄到大约x₅至少50-100％相同的序列；区段6包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基x₅到大约x₆至少50-100％相同的序列；区段7包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ IDNO：10(“5”)的氨基酸残基x₆到大约x₇至少50-100％相同的序列；及区段8包含与SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基x₇到大约x₈至少50-100％相同的序列；且其中x₁是SEQ ID NO：2、4、6或8的残基47、48、49、50、51或52，或是SEQ ID NO：10的残基48、49、50、51、52或53；x₂是SEQ ID NO：2或10的残基92、93、94、95、96或97，或是SEQ ID NO：4、6或8的残基91、92、93、94、95或96；x₃是SEQ ID NO：2的残基127、128、129、130、131或132，或是SEQ ID NO：4或6的残基125、126、127、128、129或130，或是SEQ ID NO：8的残基126、127、128、129、130或131，或是SEQ ID NO：10的残基123、124、125、126、127或128；x₄是SEQ ID NO：2的残基175、176、177、178、180或181，或是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的残基173、174、175、176、177或178，或是SEQ ID NO：8的残基174、175、176、177、178或179，或是SEQ ID NO：10的残基171、172、173、174、175或176；x₅是SEQ ID NO：2的残基221、222、223、224、225或226，或是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的残基219、220、221、222、223或224，或是SEQ ID NO：8的残基220、221、222、223、224或225，或是SEQ ID NO：10的残基217、218、219、220、221或222；x₆是SEQ ID NO：2的残基268、269、270、271、272或273，或是SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的残基266、267、268、269、270或271，或是SEQID NO：8的残基267、268、269、270、271或272，或是SEQ ID NO：10的残基264、265、266、267、268或269；x₇是SEQ ID NO：2的残基384、385、386、387、388或389，或是SEQ ID NO：4的残基385、386、387、388、389或390，或是SEQ ID NO：6的残基378、379、380、381、382或383，或是SEQ ID NO：8或10的残基383、384、385、386、387或388；并且x₈是对应于SEQ ID NO：2的残基454、SEQ ID NO：4的残基457、SEQID NO：6的残基458、SEQ ID NO：8的残基453、SEQ ID NO：10的残基455、或者具有序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的多肽的C端的氨基酸残基，且其中嵌合多肽具有纤维二糖水解酶活性和与包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的CBH I多肽相比改善的热稳定性、pH稳定性和/或表达。在前述的另一实施方案中，区段1包含SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的氨基酸残基从大约1或从大约18或19到大约x₁并具有1-10个保守氨基酸取代；区段2是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ IDNO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₁到大约x₂并具有大约1-10个保守氨基酸取代；区段3是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₂到大约x₃并具有大约1-10个保守氨基酸取代；区段4是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ IDNO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₃到大约x₄并具有大约1-10个保守氨基酸取代；区段5是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₄到大约x₅并具有大约1-10个保守氨基酸取代；区段6是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ IDNO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₅到大约x₆并具有大约1-10个保守氨基酸取代；区段7是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQ ID NO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₆到大约x₇并具有大约1-10个保守氨基酸取代；并且区段8是SEQ ID NO：2(“1”)、SEQ ID NO：4(“2”)、SEQ ID NO：6(“3”)、SEQ ID NO：8(“4”)或SEQID NO：10(“5”)的从大约氨基酸残基x₇到大约x₈并具有大约1-10个保守氨基酸取代。在前述中的任一个的又一个实施方案中，多肽与选自由SEQ IDNO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组的序列至少60-100％相同。在前述任一个的又一个实施方案中，多肽包括可操作地连接到N端氨基酸的前导序列。在前述任一个的又一个实施方案中，多肽还包括选自由SEQ ID NO：16、17和18组成的组的序列的C端CBM结构域。在前述任一个的又一个实施方案中，至少两个不同的亲本纤维二糖水解酶I(CBH I)多肽包括选自由SEQ ID NO：2、4、6、8和10组成的组的序列。在前述任一个的又一个实施方案中，多肽具有选自由以下组成的组的区段结构：55153552、12153252、25152252、12152252、55152252、55515555、55555551、55515551、55525555、55555552、55525552、55555155、55555515、55555115、55555255、55555525、55555225、34152252(SEQ ID NO：19)、55153552(SEQ ID NO：20)、32153252(SEQ ID NO：21)、55155552(SEQ ID NO：22)、22153252(SEQ ID NO：23)、52152552(SEQ IDNO：24)、12153252(SEQ ID NO：25)、45153252(SEQ ID NO：26)、12153552(SEQ ID NO：27)、25152252(SEQ ID NO：28)、13152552(SEQ ID NO：29)、12152252(SEQ ID NO：30)、55153252(SEQ ID NO：31)、55552252(SEQ IDNO：32)、55152552(SEQ ID NO：33)和55152252(SEQ ID NO：34)。