[发明专利]缀合方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于缀合的方法。特别地，它涉及使用还原胺化的糖和蛋白质的缀合。

背景技术

细菌荚膜多糖已广泛用于免疫学许多年用于预防细菌疾病。然而，关于此类使用的问题是免疫应答的T不依赖性特性。这些抗原因此在幼儿中是弱免疫原性的。这个问题已通过将多糖抗原与载体蛋白质（T辅助表位的来源）缀合得到克服，其随后可以用于甚至在生命的第一年中引发T依赖性免疫应答。

多种缀合技术是本领域已知的。缀合物可以通过如US200710184072（Hausdorff）US 4365170（Jennings）和US 4673574（Anderson）中所述的直接还原胺化法进行制备。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。缀合法可以可替代地依赖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶嗡四氟硼酸盐（CDAP）活化糖类的羟基，以形成氰酸酯。此类缀合物在PCT公开申请WO 93/15760 Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094中描述。还参见Chu C.等人Infect. Immunity，1983 245 256。

还原胺化涉及两个步骤，（1）抗原的氧化，（2）抗原和载体蛋白质的还原，以形成缀合物。氧化步骤可以涉及与高碘酸盐的反应，然而，通过高碘酸盐的氧化可以导致尺寸减小（WO94/05325）。

发明内容

本发明人已惊讶地发现在低磷酸盐的存在下使用较低浓度的高碘酸盐可以导致尺寸的保留和/或表位的保留。

在本发明的第一个方面，提供了用于缀合细菌糖类的方法，其包括步骤

a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；

b）将活化的细菌糖类与载体蛋白质混合；

c）将活化的细菌糖类和载体蛋白质与还原剂反应，以形成缀合物；

或

a）将细菌糖类与0.001-0.7、0.005-0.5、0.01-0.5、0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐反应，以形成活化的细菌糖类；

b）将活化的细菌糖类与接头混合；

c'）使用还原剂将活化的细菌糖类与接头反应，以形成细菌糖类-接头；

d）将细菌糖类-接头与载体蛋白质反应，以形成缀合物；

其中步骤a）在不含胺基团的缓冲液中发生，并且所述缓冲液具有1-100mM的浓度。

在本发明的第二个方面，提供了可通过本发明的方法获得的缀合物。

在本发明的第三个方面，提供了通过本发明的方法获得的缀合物。

在本发明的第四个方面，提供了免疫原性组合物，其包含本发明的缀合物和药学可接受的赋形剂。

在本发明的第五个方面，提供了包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。

在本发明的第六个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在预防或治疗细菌疾病中的用途。

在本发明的第七个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制备用于预防或治疗细菌疾病的药物中的用途。

在本发明的第八个方面，提供了预防或治疗细菌感染的方法，其包括给患者施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。

在本发明的第九个方面，提供了活化的细菌糖类，其中所述活化的细菌糖类包含式（I）的重复单位：

其中所述活化的细菌糖类包含n个重复单位，并且n是2 - 2400、500 - 2000、750 - 1500、1000 - 2000或1500 - 2300。

其中至少0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%或30%但小于0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、30%或50%的S1是

并且剩余部分是

其中S2是  或者 

并且其中S3是  或者。

附图说明