[发明专利]western印迹分析技术

说明书

本申请要求提交于2010年5月21日的GB1008517.3和提交于2011年1月5日的GB1100092.4的提交日期优先权，它们的公开内容以引用方式并入本文。

技术领域

本专利申请涉及进行western印迹分析(blot analytical)技术的改良的方法。

背景技术

Western印迹法是劳动密集型实验室分析方法，其广泛地应用于生命科学中以确定在复杂样品中是否存在靶蛋白质并且以确定靶蛋白质的相对量。所使用的术语“靶蛋白质”是指分析方法的使用者期望在复杂样品内辨识的蛋白质。使用蛋白质的相对数量来测量蛋白质表达中的变化(即.上调和下调)。

通过结合下述两个变量来实现确定是否存在特定蛋白质：蛋白质的分子量及其免疫特性(假定蛋白质的这两个极为不同的方面不可能偶然共存)。通过下述方式来实现确定特定蛋白质的相对数量：将复杂样品中的靶蛋白质与总蛋白质元素或常见的“持家(housekeeping)”蛋白质的数量比较。所用术语“持家”蛋白质是指涉及细胞基本功能的常见蛋白质，例如，肌动蛋白或微管蛋白。在western印迹分析中量化总蛋白质或“持家”蛋白质的第二功能是它们可被用作为加载对照。可使用总蛋白质或“持家”蛋白质存在的数量来辨识通道(lane)加载中和样品制备中的不准确性。然后，使用这些差异来归一化靶蛋白质数值，从而把这些不准确性考虑进去。

标准western印迹方法使用电泳(如，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE)分离复杂样品中的蛋白质，然后，将分离的蛋白质电转移到固体膜(通常，由硝化纤维或聚偏二氟乙烯制成，PVDF)使得蛋白质保持同样的分离模式。然后，将此膜在稀释的蛋白质溶液(如，脱脂奶粉或牛血清白蛋白(BSA))中培育，以阻断非特异性键合部位，然后使用一级抗体(即，特别用于靶蛋白质)培育，使用允许用于靶蛋白质检测的二级抗体洗和培育。这称作免疫检测。一旦用户已经确定所述样品中是否存在靶蛋白质，就将第一和第二抗体就从所述膜剥离，并且所述膜使用替代第一抗体(特别用于可用作为加载对照的另一个蛋白质)来培育，使用允许用于加载对照的检测的第二抗体来洗和培育。

通常，整个方法完成需5至8小时，尽管一些使用者喜欢将整个方法中的一些步骤过夜运行。

关于标准western印迹方法的问题包括下述事实：通常，电泳之后分离的蛋白质样品不可见，因此使用者不能容易地分析蛋白质分离的结果。可在分离之后将分离的蛋白质样品染色以使得使用者可完全可见分离的蛋白质,然而，这种方法工作强度大并且耗时。

一种用于蛋白质后分离(post separation)但在免疫检测之前的检测的常用方法是将分离介质暴露于Ponceau S染色剂。此方法需要在致使蛋白质可见之前劳动密集型的染色和脱色步骤。使用此技术显示的蛋白质通常是不明显的和缺乏捕获数字图像所需的对照。另外，免疫检测的当前方法通常使用化学发光和照相胶片，来自Poceau S染色的总蛋白质的图像将不直接与靶蛋白质的图像比较。

通常所用的另一种方法是使用两个恒定的电泳蛋白质分离物来比较蛋白质总量与靶蛋白质的总量。将一种分离介质染色以用于总蛋白质的检测而另一种介质被转移到用于靶蛋白质的免疫检测的固体膜。此方法在多种情况下(特别是贵重样品或仅小体积样品)不具吸引力。另外，正象多数人那样将样品加载到电泳设备，在不同电泳分离物之间人工比较蛋白质元素，由于不正确加载样品导致结果的不正确判读。

这表明，确定蛋白质表达所需要的附加处理步骤导致以试剂和时间的形式的附加成本。此外，如果使用标准western印迹方法，使用者不能容易地比较在免疫检测前和后从同一分离的蛋白质样品得到的结果。

关于标准western印迹方法的另一个问题是其包括多个步骤，所述多个步骤涉及若干不同设备，从而妨碍形成一体化，所述多个步骤还包括单独的设备，需要用它来对已经被探测到之后的最终样品成像。另外，这些多个步骤的多数包括湿化学，所述湿化学可导致重现性降低。例如，最广泛地使用检测靶蛋白质的方法为通过化学发光，并包括将照相胶片暴露于western印迹。为了定位与印迹接触的照相胶片，使用照相胶片需要将印迹转移到暗室，通常是远离实验室的一些地方。通常，需要显影暴露的胶片的照相胶片处理部件是昂贵的并且难于维护保养。使用照相胶片的另一个问题是获得适用于定量分析的靶蛋白质的不饱和图像需要耗时的反复试验并会出错。

总的来说，标准western印迹方法为劳动密集型的、耗时的并且使用大量试剂。

发明内容