[发明专利]用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物

说明书

技术领域

本发明涉及新型化合物、用于检测含有该化合物的腈相关酶的酶活性的荧光底物以及使用前述化合物来检测受试物的酶活性的方法。

背景技术

现在，在成为化学品原料的化合物的制备工序中，从转换率或选择率高、光学活性化合物的情况下立体选择性高方面考虑，利用酶反应。例如，在成为各种化学品原料的腈化合物(丙烯酰胺、丙烯酸等)的制备中，使用利用腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶等进行的酶反应。腈水解酶是将腈基水解转换为羧酸基的酶，腈水合酶是将腈基水合转换为酰胺基的酶，酰胺酶是将酰胺基水解转换为羧酸基的酶。

具有这些酶的微生物由以土壤为代表的自然界筛选。作为筛选方法，通常采用将以腈化合物等作为唯一的氮源或碳源而生长的微生物浓缩，从所得到的微生物中取得具有酶活性的微生物的方法。对于酶活性，使腈化合物或酰胺化合物与微生物反应，利用高效液相色谱、气相色谱等设备对产物进行分析。

另一方面，有报告指出自然界存在的微生物中，利用现在的技术可以分离、培养的微生物仅仅不足1%(M.S.Rappe andS.J.Giovannoni,Annu.Rev.Microbiol.,57,369(2003))。

因此，进行了不像现有方法那样分离微生物而是从自然界直接分离基因(环境DNA或宏基因组)，从其中筛选有用的酶基因的方法(宏基因组筛选)。为了使用该方法，谋求制作利用了宏基因组的非常多的重组体，从它们中有效地筛选具有活性的重组体的技术。然而，使用高效液相色谱、气相色谱等设备的方法欠缺高通量性。因此，谋求可以进行高通量筛选的新技术。

另一方面，作为荧光物质相关的发明，已知荧光探针或荧光标记试剂的发明(国际公开公报WO2004/005917、WO2006/019105)。然而，还不知道对本发明的酶活性的检测有用的荧光底物。

发明内容

本发明是鉴于这种情况而提出的，其要解决的问题在于，提供新化合物、用于检测含有该化合物的腈相关酶的酶活性的荧光底物以及使用前述化合物来检测受试物的酶活性的方法。

本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果开发了通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物，例如通过腈相关酶的作用而发荧光的无荧光(低荧光)的底物化合物。另外发现，通过测定本发明的底物的荧光，可以简便地检测腈相关酶的酶活性，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种检测受试物的酶活性的方法，其包含以下工序，

(a)使受试物与通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物反应的工序，和

(b)对由工序(a)中的反应而产生的荧光的波长和强度进行测定的工序。

(2)根据上述(1)所述的方法，其中，酶活性为选自由腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶所组成组中的一种酶的活性。

(3)根据上述(1)所述的方法，其中，通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物为下述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物，

式中，R¹表示-CN、-CONH₂、-CH=CH-CN或-CH=CH-CONH₂，R²表示C_1-4烷基，R³和R⁴各自独立地表示氢原子、卤原子或C_1-4烷基，R⁵表示氢原子、C_1-4烷基羰基或C_1-4烷基羰基氧基甲基。

(4)根据上述(3)所述的方法，其中，R¹为-CN或-CH=CH-CN，腈相关酶为腈水解酶或腈水合酶。

(5)根据上述(3)所述的方法，其中，R¹为-CONH₂或-CH=CH-CONH₂，腈相关酶为酰胺酶。

(6)根据上述(1)所述的方法，其中，荧光使用流式细胞术测定。

(7)一种下述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物，